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L’étude de la protéine P1 chez quelques souches de référence, par agglutination dans leur sérum P1 homologue et dans des sérums P1 hétérologues, nous a permis d’établir un schéma de la diversité antigénique de la protéine P1 pour ces souches ; ce schéma est confirmé par des techniques de biologie moléculaire.
Deux particularités de la protéine P1 – sa structure en fibrilles et son caractère de protéine de membrane externe attachée à la surface de la bactérie - nous ont permis de la mettre en évidence par cette technique simple qu’est l’agglutination sur lame.
La détection de P1 réalisée en parallèle avec les tests de CA++ dépendance et d’autoagglutination définit cette protéine non seulement comme marqueur de virulence mais aussi comme témoin de la présence du plasmide pYV.
Enfin, la mise en évidence des divers facteurs de P1 sur un vaste échantillon de souches pathogènes introduit de nouvelles subdivisions ne correspondant pas à la classification en biosérogroupes. La protéine P1 constitue dès lors un marqueur de choix pour des études épidémiologiques

Yersinia enterocolitica

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Delmée et al. ont établi l’existence d’un antigène spécifique de vingt et un groupe de C. difficile.
La technique d’agglutination sur lame ne permet cependant de distinguer que six sérogroupes.
Nous avons mis au point une méthode de typage rapide et permettant d’une part une distinction spécifique des vingt et un sérogroupes et d’autre par la détection rapide d’antigènes dans les selles.
C’est la méthode d’agglutination par comptage de particules (PACIA) que C. Cambiaso et P. Masson ont proposé en 1977 que nous avons employée.
Cette méthode permet de détecter les agglutinations d’antigènes libres avec des anticorps spécifiques. la lecture est électronique. La technique PACIA étant de spécificité équivalente aux autres méthodes immunochimiques (ELISA, RIA,..) a pour avantage sa sensibilité et sa rapidité.
Dans les limites de temps données, Nous avons entrepris la mise au point de réactifs latex spécifiques pour une première série de six sérogroupes A1, A8, C, F, H et K, choisis à cause de leurs implications épidémiologiques particulières :
- A1, c, H et K sont impliqués dans 75 % des cas de la CPM, forme de pathologie la plus grave que puisse causer le C . difficile.
- F est le sérogroupe toxigène retrouvé le plus souvent chez les enfants asymptomatiques.
Nous avons divisé ce travail en plusieurs parties :
1. Purification de l’antigène spécifique de sérogroupe
Après culture de 24 heures en milieu liquide, les antigènes ont été extraits du corps bactérien par l’acidification à ph 2, purifiés par des centrifugations successives à haute vitesse et concentrés par dialyse et lyophilisation.
La séparation des antigènes purifiés a été faites par PAGE. L’antigène spécifique de sérogroupe a été isolé par élution, puis lyophilisé et conservé à -20°C jusqu’à l’emploi.
2. Obtention d’antisérums monospécifiques
L’antigène spécifique a été re-suspendu dans du PBS et injecté aux lapins à raison d’une injection intradermique par semaine, six semaines de suite. La septième semaine le lapin a été saigné.
Titres finals et spécificités des antisérums ont été contrôlés par des méthodes immunochimiques (agglutination sur lame ou en microplaque, immunodiffusion d’Ouchterlony, immunotransfert ou préparation d’un latex adsorbé).
3. Mise au point d’un réactif covalent pour chaque antisérum groupe-spécifique.
La préparation des réactifs latex a consisté à purifier les IgG des antisérums spécifiques, digérer les IgG à la pepsine pour en préparer des F(ab-)2 purifier ces F(ab’)2 par filtration moléculaire et les couper covalement sur des billes de polystyrène.
Les conditions optimales d’usage des réactifs latex ont été définies. La charge en F(ab’)2 par 50 μl de latex vierge, l’emploi nécessaire ou non d’un adjuvant accélérateur des réactions AG-AC, le choix de la préparation antigénique, ont été des facteurs à déterminer ;
4. Applications des réactifs latex au sérogroupage de C. difficile et à la détection rapide d’antigènes dans les selles.
Une fois le réactif latex mis au point, nous avons essayé d’établir des protocoles pour un emploi spécifique du réactif dans les deux domaines :
le sérogroupage et la détention antigénique dans les selles.
Pour le sérogroupage de souches de C. difficile des distinctions parfaitement spécifiques ont été obtenues avec tous les latex lorsqu’on dilue l’échantillon 10-3 dans du PBS/BSA 1%.
Pour la détection dans les selles nous avons été confronté au problème d’interférences aspécifiques dues à la composition des matières fécales.
Différents traitements biochimiques nous ont permis de conclure à une nature protéique des interférences.
Pour éliminer ces interférences, nous avons mis au point et testé différents traitements, avant d’aboutir à un protocole qui nous a permis, pour le latex A1, la distinction parfaitement spécifique entre des extraits de selles du sérogroupe homologue A1, des extraits négatifs et des extraits positifs en C. difficile de sérogroupes hétérologues.
Ces résultats, tout en étant préliminaires, sont néanmoins encourageants, mais doivent encore être confirmés avec les autres sérogroupes

Clostridium difficile --- Typing, Bacterial --- Medical Laboratory Science

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Allergen-specific immunotherapy reorientes cellular and humoral responses in allergic patients, by inducing specific tolerance. It was previously shown an important increase in serum IgS antibodies (mainly IgG4) following specific immunotherapy, with a blocking effect on various steps of the allergic reaction (antigenic presentation, basophil degranulation). An increase in specific IgA was recently observed in our laboratory, in the serum of patients treated by immunotherapy. In order to study the role of IgA antibodies in the development of tolerance, we believe interesting to purify these antibodies induced in the serum of patients treated by immunotherapy (for Phleum Pratense, Phl p). More specifically, effects of these IgA antibodies on the induction of interleukin-10 (IL-10) in the monocytes and on the inhibition od degranulation of the basophils will be assessed. Patients’ sera were successively purified by affinity chromatography, pooled and concentrated by ultrafiltration immunoglobulins of the IgG (protein G column), IgA1 (column of Jacaline) and IgA2 (anti-IgA column) subclasses. We then showed ELISA that the fractions obtained had been enriched in IgG, IgA1 and IgA2, and contained Phl p allergen-specific antibodies. Using a Phl p immunoadsorbant we isolated by affinity chromatography specific IgG antibodies. The purification of IgA antibodies using the same technique should allow their functional study. L’immunothérapie allergénique réoriente les réponses immunitaires cellulaires et humorales du patient allergique, en induisant une tolérance spécifique. Il a été démontré précédemment, en réponse à l’immunothérapie spécifiques, une augmentation importante des anticorps IgG sériques (principalement IgG4) exerçant un effet bloquant dur différentes étapes de la réaction allergique (présentation antigénique, dégranulation des basophiles). Parallèlement, une augmentation de IgA spécifiques a été récemment observée par notre laboratoire dans le sérum de patients traités au long cours par immunothérapie. Il nous a dès lors semblé intéressant de purifier les anticorps des différents sous-classes d’immunoglobulines (Igs) présentes dans le sérum de patients allergiques (rhinite avec/sans asthme) traités par immunothérapie (au pollen de la Phléole des Prés, Phl p) afin d’étudier le rôle de ces anticorps dans le développement d’une tolérance vis-à-vis de l’allergène. Plus spécifiquement, un effet de ces anticorps IgA est recherché sur l’induction d’interleukine-10 (IL-10) dans les monocytes et sur l’inhibition de la dégranulation des basophiles. A partir de séra de patients nous avons successivement purifié par chromatographie d’affinité, poolé et concentré par ultrafiltration les Igs de type IgG (colonne de protéine G), IgA1 (colonne de jacaline) et IgA2 (colonne anti-IgA). Nous avons alors démontré par ELISA que les différents fractions obtenues avaient bien été ernichies en IgG, IgA1 et IgA2, et contenaient des anticorps spécifiques de l’allergène Phl p. Enfin, nous sommes parvenus à isoler par chromatographie d’affinité (immunoadsorbant Phl p) les IgG spécifiques et probablement, après différentes modifications méthodologiques, les IgA spécifiques de Phl p.

Immunotherapy --- Hypersensitivity --- Immunoglobulin A --- Allergens --- Anti-Bacterial Agents

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Deux méthodes sont utilisées pour la quantification des anticorps dirigés contre le VIH dans les tests d’Elisa et d’immunoempreinte. La première donne une estimation de la présence d’anticorps par lecture de l’absorbance au spectrophotomètre pour l’Elisa et au densitomètre pour le Western Blot. La seconde méthode consiste à quantifier exactement la proportion d’immunoglobulines qui se fixent au support solide des tests par comptage radioactif et de déduire l’attachement spécifique des anticorps.
La lecture en absorbance des différents tests montre toujours une saturation pour les dilutions d’immunoglobulines choisies. La zone de linéarité de réponse dans laquelle l’absorbance varie en fonction de la quantité d’immunoglobulines anticorps fixés peut être calculée par comptages radioactifs. Cette « fenêtre » est très étroite pour les tests Elisa Abbott et Behring (0.6 et 1.8 ng), un peu plus large pour Organon (6.9 ng) et impossible à déterminer pour Wellcome et l’Elisa « maison ». La quantification des Elisa par la mesure de l’absorbance est donc difficile. L’immunotransfert, par contre, montre une zone de linéarité de réponse beaucoup plus large permettant la quantification au densitomètre jusqu’à 330 ng d’immunoglobulines anticorps fixés sur la bande de nitrocellulose.
La méthode radioactive, c’est-à-dire l’estimation de la proportion d’anticorps fixé en fonction de la quantité totale d’immunoglobulines, montre une zone de linéarité plus longue pour Abbott (3 à 5 ng) et Behring (11 à 42 ng) et ne donne pas de signe de saturation dans les dilutions choisies pour Organon et l’immunotransfert.
La sensibilité des différents tests peut être estimée par la plus eptite quantité d’anticorps fixée qui donne encore un résultat positif. Pour l’ensemble des 2lisa étudiés, le type indirect (Abboott HIV 1, HIV 1+2 ; Berhing HIV 1+2 et Organon) apparaît plus sensible que le test par compétition (Berhing HIV 1, Wellcome et l’Elisa « maison ») ; le premier type détecte des quantités d’anticorps de l’ordre du dixième de ng alors que le second type d’Elisa donne un résultat positif à partir du minimum 4 ng.
Si on admet que la limite de visibilité d’une bande spécifique sur la nitrocellulose constitue la sensibilité de l’immunotransfert ; alors que celui-ci est certainement le test le plus sensible (la limite de visibilité à l’œil nu est de 0.04ng). L’Elisa peut donc donner un résultat faussement négatif alors que l’immunotransfert montre une bande colorée (33).
La spécificité des tests peut également être discuter ; nous l’apprécions en quantifiant l’attachement dit non spécifique par rapport au spécifique. Sans conteste, l’immunotransfert est le test le plus spécifique. En Elisa, la fixation non spécifique « affinité zéro, capacité maximum » est particulièrement élevée pour deux tests par compétition (Wellcome et Elisa « maison ») ; néanmoins, cet attachement non spécifique ne semble pas influencer la quantification par spectrophotométrie.
Parmi les tests de détection des anticorps dirigés contre le VIH, le plus sensible et le plus spécifique est l’immonuempreinte. Il offre, en plus, l’avantage de pouvoir estimer la proportion d’anticorps dirigés contre les différentes protéines virales. La quantification par densitométrie n’est réalisable qu’en dessous du plateau de saturation. Une estimation précise de la quantité d’anticorps par densitométrie serait possible par l’emploi d’une standardisation interne.
La quantification par comptages radioactifs est beaucoup plus précise et permet d’estimer la proportion exacte d’anticorps fixés. Il est maintenant accepté qu’il y a une corrélation entre l’état de santé du patient et la perte ou la persistance de certains anticorps. Il serait intéressant pour le clinicien de connaître de façon précise les quantités d’anticorps qui interviennent dans els tests ; pour cela, la méthode radioactive serait bienvenue mais son utilisation en clinique nécessiterait que les immunoglobulines de chaque patient soient purifiées, quantifiées et iodées

Immunologic Tests --- HIV Antibodies --- Diagnosis, Laboratory --- Medical Laboratory Science

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PURPOSE OF THE STUDY To assess the resistance percentage of some indicator bacteria (E. coli and Enterococcus spp.) isolated from stools of non hospitalised healthy individuals. To detect extended spectrum beta-lactamases (ESBL) producing E. coli and vancomycin resistant enterococci (VRE). To assess the emergence and the persistence of resistant organisms by a weekly examination of children stools.
MATERIEL AND METHODS A stool has been collected from 151 healthy individuals from 0 to 78 years old and from 54 day nursery children. The weekly follow-up was performed in 12 young children (< 4 years) in order to obtain 12 samples per child. Resistant strains were detected by enrichment procedure and selective media. Identification was done by conventional biochemical methods. Their susceptibility was tested by the agar diffusion methods. Several tests (double E-test ®, diffusion discs, IEF and PCR) were carried out to confirm BLSE production. Whether the resistant strains belonged to the same clone or not was determined by Pulsed Field Get Electrophoresis (PFGE).
RESULTS 135 E. coli strains have been isolated from stool cultures of healthy individuals. The main resistance percentages were 38.5 ; 22.2 ; 11.1 and 9.6 % for ampicillin, ciprofloxacin, sulfamethoxazol/trimethoprim and amoxicillin/clavulanic acid respectively. Two strains (1.5%) produced ESBL (CTX-M-1 and TEM-52). Such a strain was also isolated from the stools of a child in the follow-up study. Five strains were hyperproducers of cephalosporinases and one strain produced type TEM-1 beta-lactamase. Resistance percentages to ciprofloxacin and sulfamethoxazol/trimethoprim were higher than in the 37 strains isolated from day nursery children. PFGE indicated the presence of one single clone in a day nursery and the presence of one single clone on the faecal flora of persons living together. The highest resistance percentages in E. faecalis (n=43) were recorded for tetracycline, erythromycin and ciprofloxacin reached 14.3 ; 87.5 and 65.7 % respectively. No VRE strain was isolated. During the weekly follow-up study, transient emergence of resistance bacteria and modifications of the faecal flora were observed following antibiotic therapy.
CONCLUSION
- The faecal flora of community people harbours resistance genes.
- Colonisation by ESBL producing E. coli occurs even in people without antibiotherapy or hospitalisation history. However, it may be transient.
- Only resistance to ciprofloxacin, sulfamethoxazol/trimethoprim and, gentamicin was different in the community people as compared to day nursery children.
- No difference was observed between people with antibiotic history and those without it OBJECTIFS Mesurer les taux de résistance aux antibiotiques des bactéries marqueurs de résistance (Escherichia coli et Enterocuccus spp.) isolées de selles de différents groupes de sujets sains non hospitalisés. Recherches des E. Coli producteurs de bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE) ainsi que des entérocoques résistants à la vancomycine (VRE). Evaluer chez une cohorte d’enfants l’émergence et la persistance au cours du temps de germes résistants par une analyse hebdomadaire de selles.
METHODES Un échantillon de selles a été récolté chez 151 volontaires sains non hospitalisés (0 à 78 ans) ainsi que chez 54 enfants à la crèche. Un suivi hebdomadaire a été réalisé chez 12 enfants en bas âge (≤ 4 ans) de manière à obtenir douze prélèvements par enfant. Les souches résistantes ont été isolées au moyen de techniques d’enrichissement et de milieux sélectifs. Elles ont été identifiées par les méthodes biochimiques classiques. La sensibilité aux antibiotiques a été déterminée par la méthode de diffusion en gélose. Différents tests (doubles E-test®, doubles disques, IEF et PCR) ont permis de confirmer la production de BLSE ? La clonalité de différentes souches a été déterminée par électrophorèse de l’ADN génomique en champ pulsé (PFGE).
RESULTATS 135 souches d’E. coli ont été isolées dans les selles des volontaires sains. Les taux de résistance les plus importants étaient respectivement de 38.5, 22.2, 11.1 et 9.6 % pour l’ampicilline, la ciprofloxacine, la sulfaméthoxazole/triméthoprime et l’amoxicilline/ acide clavulanique. Deux souches (1.5%) étaient productrices de BSLE (de type CTX-M-1 et TEM-52). Une BLSE de type TEM-52 a aussi été isolée des selles d’un enfants suivi. Quatre souches étaient hyperproductrices de cépalosporinase AmpC et une couche produisait une bêta-lactamase de type TEM-1. Les taux de résistance à la ciprofloxacine et au sulfaméthoxazole/triméthoprime étaient plus importants dans la population générale adulte que chez les enfants de la crèche. La technique de typage par PFGE a permis de mettre en évidence la circulation d’un clone dans une crèche ainsi que la présence de clones identiques dans la flore intestinale de personnes vivant sous le même toit. Les taux de résistance les plus élevés chez les E. faecalis (n=43) étaient observés pour le tétracycline (53.5%), l’érythromycine (51.2%) et la ciprofloxacine atteignait respectivement 14.3 ; 87.5 et 65.7%. Aucune souche de VRE n’a été isolée. Lors du suivi hebdomadaire, l’émergence transitoire de bactéries résistantes ainsi que le modification de la flore intestinale suite à une prise d’antibiotiques ont pu être mises en évidence.
CONCLUSIONS
- La flore intestinale des personnes dans la communauté constitue un réservoir de gènes de résistance ; la colonisation par de E. coli produisant des BLSE existe et ce, même chez des personnes n’ayant aucun antécédent d’antibiothérapies ni d’hospitalisation. Cette colonisation peut être transitoire.
- Seuls les taux de résistance à la ciprofloxacine, au sulfaméthoxazole/triméthoprime et à al gentamicine étaient différents dans la population générale par rapport aux taux observés à la crèche.
- Aucune différence de taux de résistance n’a été observée entre les personnes ayant des antécédents d’antibiotiques et ceux qui n’en ont pas

Drug Resistance, Bacterial --- Escherichia coli --- Enterococcus faecalis