Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Over the course of evolution, fungi have adapted to occupy specific niches, from symbiotically inhabiting the flora of the intestinal tract of mammals to saprophytic growth on leaf litter resting on the forest floor.  In Plant Fungal Pathogens: Methods and Protocols, expert researchers in the field detail many of the methods which are now commonly used to study fungal plant pathogens. These include methods and techniques for model systems such as Arabidopsis thaliana as well as crop plants, aspects of fungal biology, genome annotation, next-generation sequencing, and fungal transformation and molecular tools for disease and/or pathogen quantification that are critical for revealing the role for a fungal gene of interest in disease development. Written in the highly successful Methods in Molecular Biology™ series format, chapters include introductions to their respective topics, lists of the necessary materials and reagents, step-by-step, readily reproducible laboratory protocols, and key tips on troubleshooting and avoiding known pitfalls.   Authoritative and practical, Plant Fungal Pathogens: Methods and Protocols seeks to aid scientists in the further study in current techniques that cover a wide-range of methods to study molecular aspects of pathogenesis.

Botany. --- Plant diseases. --- Plant Sciences. --- Plant Pathology. --- Botany --- Communicable diseases in plants --- Crop diseases --- Crops --- Diseases of plants --- Microbial diseases in plants --- Pathological botany --- Pathology, Vegetable --- Phytopathology --- Plant pathology --- Plants --- Vegetable pathology --- Agricultural pests --- Crop losses --- Diseased plants --- Phytopathogenic microorganisms --- Plant pathologists --- Plant quarantine --- Botanical science --- Phytobiology --- Phytography --- Phytology --- Plant biology --- Plant science --- Biology --- Natural history --- Pathology --- Diseases and pests --- Diseases --- Wounds and injuries --- Floristic botany

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Accurate detectie en identificatie van plantpathogenen zijn onontbeerlijk voor de diagnose van plantenziekten dat de basis vormt van een veilige en duurzame gewasbescherming. De specifieke tekortkomingen van de klassieke kweek- en morfologie-gebaseerde identificatiemethoden hebben geleid tot de ontwikkeling van moleculaire benaderingen die geen kweek van de te identificeren micro-organismen vereisen. In de laatste decennia zijn verschillende serologische en nucleïnezuurgebaseerde technieken ontwikkeld voor het opsporen en identificeren van plantpathogenen (Hoofdstuk 1). Bepaalde van deze technieken laten bovendien een betrouwbare kwantificatie van de doelwitpathogeen toe en verschaffen aldus de vereiste informatie voor het inschatten van de risico’s wat betreft ziekteontwikkeling, inoculumverspreiding en economische verliezen. De belangrijkste uitdaging bij de aanvang van het onderzoek beschreven in deze thesis bestond erin een multiplex test te ontwikkelen die geschikt is voor het gelijktijdig opsporen en kwantificeren van een breed gamma aan plantpathogenen.In deze thesis wordt de ontwikkeling van een DNA “macroarray” beschreven die aan deze vereisten voldoet. In eerste instantie werden de algemene voorwaarden bepaald voor het ontwikkelen van selectieve detectoroligonucleotiden (Hoofdstuk 2). De bruikbaarheid van DNA “arrays” om “single nucleotide polymorphisms” te detecteren is aangetoond door specifieke criteria zoals de positie van de “mismatch”, de sequentie van het oligonucleotide en de lengte en hoeveelheid van de gemerkte amplicons in acht te nemen. Op basis van deze criteria werd vervolgens een DNA “macroarray” ontwikkeld die getest is voor een snelle en efficiënte detectie en identificatie van een beperkte set schimmelpathogenen in biologisch complexe stalen zoals plant- en grondstalen (Hoofdstuk 3). Als “proof-of-principle” werd de “macroarray” ontwikkeld voor een aantal belangrijke ziekteverwekkers van tomaat dat wereldwijd één van de economisch belangrijkste vruchtgewassen is. Meer bepaald werd gekozen voor de vaatbundelpathogenen Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici , Verticillium albo-atrum en V. dahliae . In Hoofdstuk 5 werd deze “array” verder geoptimaliseerd om een accurate kwantificatie van de pathogenen te bewerkstelligen over tenminste drie grootte-ordes die praktijkrelevant zijn. Een sterke correlatie werd vastgesteld tussen de hybridisatiesignalen en de pathogeenconcentraties, zowel voor standaard DNA (al dan niet in aanwezigheid van niet-doelwit DNA) als voor besmette stalen. Wanneer specifieke criteria zoals de hoeveelheid gebonden oligonucleotiden en bepaalde controles voor het amplificatieproces in acht werden genomen, kon een accurate kwantificatie bewerkstelligd worden voor praktijkrelevante pathogeenconcentraties. Gezien kwantificatie op basis van kweekmethoden als relatief onnauwkeurig of zelfs onbetrouwbaar wordt beschouwd, werd real-time PCR, een reeds gevestigde techniek om DNA te kwantificeren (Hoofdstuk 4), als referentietechniek gebruikt ter validatie van de kwantificering met behulp van de DNA “array”. Het feit dat beide kwantificatiemethoden sterk gecorreleerd waren illustreert de betrouwbaarheid en robuustheid van het kwantitatieve karakter van DNA “macroarrays”. In het kader van een geïntegreerde gewasbeschermingstrategie werd tenslotte een kwantitatieve “macroarray” ontwikkeld om simultaan zowel pathogenen als biocontrole agentia te detecteren, alsook om hun interacties te bestuderen en hun aanwezigheid te koppelen aan ziekteontwikkeling en symptoomexpressie. Doordat momenteel geen gestandaardiseerde biotoets beschreven is voor tomaat, werd de reeds uitvoerig bestudeerde interactie tussen het biocontrole agen Trichoderma hamatum isolaat 382 en de pathogeen Rhizoctonia solani aangewend in een standaard biotoets van R. solani, de veroorzaker van omvalziekte, op radijs (Hoofdstuk 6). Uit deze studie kan geconcludeerd worden dat DNA “macroarrays” met succes kunnen gebruikt worden voor het gelijktijdig detecteren en kwantificeren van verschillende plantpathogenen in biologisch complexe stalen. Naast zijn toepassingsmogelijkheden voor het routinematig detecteren van plantpathogenen, heeft deze techniek bovendien het potentieel om ingezet te worden in diverse ecologische en epidemiologische studies. Accurate detection and identification of plant pathogens are fundamental to plant pathogen diagnostics and thus plant disease management. The specific limitations of culture-based morphological techniques to adequately identify plant pathogens have led to the development of culture-independent molecular approaches. In the last two decades, many different serological and nucleic acid-based techniques have been developed for the detection and identification of plant pathogens (discussed in Chapter 1). Some of these techniques also permit reliable quantification of the target pathogen, and supply the information that is required to estimate risks with respect to disease development, spread of the inoculum, and economic losses. The major challenge at the start of the research described in this thesis was the development of a multiplex assay that allows accurate detection and quantification of multiple pathogens in a single assay. In this thesis, the development of a DNA macroarray is described to meet these requirements. First, the overall conditions were determined for the design of highly discriminative detector oligonucleotides (Chapter 2). The utility of DNA array technology is shown to distinguish single base pair differences while accounting for specific criteria such as the position of the mismatch, the sequence of the oligonucleotide, and the length and amount of labeled amplicons that are hybridized. Based on these results, a DNA macroarray was designed for rapid and efficient detection and identification of a comprehensive set of fungal pathogens in complex samples, including artificially and naturally infested plant and soil samples (Chapter 3). As a proof-of-principle, the array was developed for a number of economically important fungal pathogens of tomato which is one of the most important vegetable crops worldwide. The pathogens selected for this study comprised the vascular wilt pathogens Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Verticillium albo-atrum, and V. dahliae. In Chapter 5, this array has been further optimized for accurate pathogen quantification over at least three orders of magnitude. A strong correlation was observed between hybridization signals and pathogen concentrations for standard DNA, in the absence of or added to non-target DNA from different origins, and for infested samples. While accounting for specific criteria like amount of immobilized detector oligonucleotide and specific controls for PCR kinetics, accurate quantification of pathogens was achieved in concentration ranges typically encountered in horticultural practice. Since quantification based on culturing techniques is considered relatively inaccurate, real-time PCR, a well-established and reliable technique to quantify DNA levels (Chapter 4), was used as a reference technique to validate DNA array-based quantification. As both methods of quantification showed a very high degree of correlation, the reliability and robustness of the DNA array technology is shown. Finally, in the frame of an integrated pest management (IPM) based disease management strategy, a quantitative DNA macroarray was developed to simultaneously monitor populations of pathogens and biocontrol agents, as well as to investigate their interactions, and relate their presence to disease development. Since currently no standard biocontrol assay was available for the model crop tomato, the well established interaction between the biocontrol agent Trichoderma hamatum isolate 382 and the pathogen Rhizoctonia solani was used in a standard damping-off of radish bioassay (Chapter 6). Altogether, it is shown that DNA macroarrays can be successfully used to simultaneously detect and quantify multiple plant pathogens in samples from various biological sources including those gathered from horticultural practice. Apart from its applicability in routine plant pathogen diagnosis, this technique has the potential to become a reliable tool for diverse ecological and epidemiological studies. In gewassen kunnen tal van ziekteverwekkers huizen die kunnen leiden tot enorme economische verliezen. Een precieze en tijdige identificatie van de ziekteverwekkers en een vaststelling van de concentratie waarin ze voorkomen liggen aan de basis van een duurzame gewasbescherming. Tot voor kort gebeurde een diagnose meestal op basis van de uiterlijke kenmerken van de getroffen planten of na opzuivering en morfologische identificatie van de ziekmakers. De specifieke tekortkomingen van deze klassieke kweek- en morfologie-gebaseerde identificatiemethoden hebben geleid tot de ontwikkeling van alternatieve, en meer bepaald moleculaire, benaderingen die geen kweek van de te identificeren micro-organismen vereisen. Hoewel de meeste van deze benaderingen wel efficiënt zijn om één ziekteverwekker op te sporen, voldoen ze echter niet wanneer men meerdere ziekten tegelijk wenst vast te stellen. De belangrijkste uitdaging bij de aanvang van het onderzoek beschreven in deze thesis bestond er dan ook in een multiplex test te ontwikkelen die geschikt is voor het gelijktijdig opsporen en kwantificeren van een breed gamma aan plantpathogenen. In deze thesis wordt de ontwikkeling van een DNA “macroarray”, in essentie een rooster van specifieke DNA fragmenten (detectoren), beschreven die aan deze vereisten voldoet. Met deze technologie wordt een onbekend DNA staal in contact gebracht met het DNA-rooster en kunnen na aflezing van de resultaten de pathogenen snel en efficiënt geïdentificeerd worden. Als ‘proof-of-principle’ werd de test ontwikkeld voor een set ziekteverwekkende schimmels van tomaat. Precieze identificatie kan volgen binnen 36 uur, in plaats van binnen enkele dagen tot een paar weken voor de meer traditionele methoden. Voordeel is ook dat de opsporing van nieuwe ziekten eenvoudig aan de test kan toegevoegd worden en dat analoog testen voor andere gewassen kunnen ontwikkeld worden. Algemeen kan uit deze studie geconcludeerd worden dat DNA “macroarrays” met succes kunnen gebruikt worden voor het gelijktijdig detecteren en kwantificeren van verschillende plantpathogenen in biologisch complexe stalen. Naast zijn toepassingsmogelijkheden voor het routinematig detecteren van plantpathogenen, heeft deze techniek bovendien het potentieel om een essentieel onderdeel te worden in een nieuw gewasbeschermingsbeleid, alsook om ingezet te worden in diverse ecologische en epidemiologische studies. Plant pathogens cause diseases that take their share of food and feed production. Accurate detection and quantification of pathogenic microorganisms have become increasingly important in phytodiagnostics and disease management strategies. Classically, the predominant techniques used to identify plant pathogens have relied upon culture-based morphological techniques. However, the specific limitations of these methods to adequately identify plant pathogens have led to the development of alternative, molecular, approaches. However, although most of these approaches are generally effective, they often target only a single or a few pathogens per assay, making comprehensive screening of samples laborious, inefficient, and time-consuming. Therefore, the major challenge at the start of the research described in this thesis was the development of a multiplex assay that allows accurate detection and quantification of multiple pathogens in a single assay. In this thesis, the development of a DNA macroarray is described to meet these requirements. With this technology, labeled DNA targets made from the sample that needs to be analyzed are brought into contact with an array of membrane-bound specific DNA fragments (called "detector oligonucleotides") to identify the pathogens. The DNA array was developed and optimized for sensitive detection, specific identification and accurate quantification of multiple tomato pathogens. Precise identity can be determined within 36 hours from sampling instead to a few weeks for more traditional techniques. Furthermore, this DNA array was used to estimate disease severity as well as incidence of severe disease based on pathogen population densities. Altogether, it is shown that DNA macroarrays can be successfully used to simultaneously detect and quantify multiple plant pathogens in samples from various biological sources including those gathered from horticultural practice. Apart from its applicability in routine plant pathogen diagnosis, this technique has the potential to aid the further development of novel crop protection strategies and to become a reliable tool for diverse ecological and epidemiological studies.