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In this work, we characterized the potassium current in three types of preparations : vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated enzymatically from the mesenteric artery of Wistar and Wistar Kyoto (WKY) rats, and cells in primary culture obtained from the Wistar mesenteric artery by the explant procedure. We tried to determine the involvement of three isoforms of the voltage-dependent potassium channel in this potassium current : Kν1.5, Kν2.1 and Kν3.4.
In a first step, we had to demonstrate these Kν isoforms in the tissue and cells examined. We used two techniques : Western Blotting, to investigate protein expression, and RT-PCR, to analyze mRNA levels. Semi-quantitative RT-PCR was more successful than Western Blotting, allowing us to conclude thath : (1) the three isoforms, but mainly Kν2.1, were expressed in enzymatically isolated WSMCs, whereas only Kν2.1 was detectable in explant-derived cultured cells ; (2) the expression level of Kν1.5 was distinctly higher on WKY than in Wistar rats.
The patch-clamp technique allowed us t measure the global electrophysiological activity of Kν channels in enzymatically isolated cells (Wistar and WKY) and cultured cells (explant). We analyzed the current intensity (in Ca-free solution) and the degree of inactivation as a function of voltage. Our results indicate that : (1) the Kν density was distinctly higher in VSMCs from WKY compared to those from Wistar rats ; (2à Kν current inactivated at more in VSMCs from WKY compared to those from Wistar rats ; (3) in cultured cells (explant), the Kν density was very low.
Although the patch-clamp data were compared with those from RT-PCR, we cannot conclude that Kν3.4 plays a major role in the differences observed in patch-clamp experiments between Wistar and WKY rats, because (1) this isoform seemed to be expressed only weakly is VSMCs from mesenteric artery, even in WKY rats, and (2) our RT-PCR analysis was restricted to three isoforms Dans ce travail, nous avons caractérisé le courant potassique dans trios types de préparations : des cellules musculaires lisses vasculaires (CLMVs) isolées enzymatiquement à partir d’artère mésentérique de rats Wistar et Wistar Kyoto (WKY) et des cellules en culture primaire provenant d’explant d’artère mésentérique de rat Wistar. Nous avons tenté de déterminer l’implication de trois isoformes des canaux potassiques voltage)dépendants (Kν) dans ce courant K+ : les Kν1.5, Kν2.1 et Kν3.4.
Dans un premier temps, il fallait s’assurer de la présence de ces Kν dans les tissus à analyser. Deux techniques ont été utilisées : le Western Blot, qui nous indique si ces protéines sont exprimées, et la RT-PCR semi-quantitative, qui nous renseigne sur la présence d’ARNm de ces canaux. C’est essentiellement grâce à la RT-PCR semi-quantitative que nous pouvons conclure que (1) les trois isoformes, mais surtout le Kν2.1, sont exprimées dans les CMLVs isolées enzymatiquement, alors que seul Kν2.1 est détectable dans les cellules cultivées à partir d’explant ; (2) l’expression des Kν au niveau des artères mésentériques de rats Wistar et WKY sont équivalentes en ce qui concerne les Kν1.5 et Kν2.1, alors que l’expression des Kν3.4 est nettement plus importante chez les rats WKY que chez les rats Wistar.
La technique du patch clamp nous a permis de mesurer l’activité électrophysiologique globale des Kν au niveau de cellules obtenues enzymatiquement (Wistar et WKY) et de cellules cultivées à partir d’explant. Des analyses d’intensité de courant potassique (solutions sans Ca2+) en fonction du voltage ainsi que des courbes d’inactivation en fonction du voltage ont été effectuées. Les résultats obtenus indiquent que (1) la densité des canaux potassiques est nettement plus élevée au niveau des CMLVs de rats WKY que dans les CMLVs des rats Wistar ; (2) les Kν s’inactivent à des voltages plus positifs dans les cellules de rats WKY que dans celles de rats Wistar ; (3) avec les cellules d’explant, la densité de courant potassique observée est très faible.
Bien que les résultats obtenus en patch clamp soient compatibles avec ceux fournis par la RT-PCR, nous ne pouvons conclure que le Kν3.4 joue un rôle majeur dans les différences observées en patch clamp entre rats Wistar et WKY, puisque un rôle majeur dans cet isoforme paraît peu exprimé dans l’artère mésentérique, même chez le rat WKY, et que d’autre part notre analyse en RT-PCR s’est limitée à 3 isoformes

Myocytes, Smooth Muscle --- Potassium Channels, Voltage-Gated --- Mesenteric Arteries --- Rats