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HIV protease inhibitor and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors are important antiretroviral drugs which substantially reduced the morbidity and mortality associated with HIV infection. Recent data have shown relationships between plasma concentrations of these two classes of antiretroviral drug and the clinical response. Therefore, in order to maximise the efficiency and to decrease the toxicity of these drugs, therapeutic drug monitoring appears as a valuate tool.
First, we have developed and validated an analytical method using liquid chromatography coupled with electrospray mass spectrometry (LC-MS/MS) for the simultaneous quantification of 7 antiretroviral agents; five protease inhibitors (atazanavir, saquinavir, lopinavir, ritonavir and tipranavir) and two non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (nevirapine and efavirenz). An analytical run takes 10 minute and the method was validated on a concentration range from 10 to 500 ng/ml. the limits of detection and quantification range from 6.5 to 41.1 ng/ml except for efavirenz and tipranavir, for which these values are somewhat higher.
Second, we tested the implication of the P-glycoprotein (P-gp) in the transmembrane transport of these drugs in order to better understand the great interindividual variations on their pharmacokinetics. This study was performed in two models : in vitro with Caco-2 cells and in vivo in mice deficient for the gene coding for the P-gp. In vitro experiments showed that all tested protease inhibitors are P-gp substrates. Atazanavir seemed to have the greatest functional impact of P-gp genetic polymorphisms. In contrast, non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors do not appear to be P-gp substrates. In vivo results are not very conclusive. In vitro results were confirmed in vivo for nevirapine only.
In conclusion, this work provides a sensitive and rapid method for the simultaneous quantification of seven antiretroviral drugs. It open the way for pharmacogenetic investigations over protease inhibitors and more particularly atazanavir Les inhibiteurs de la protéase et les inhibiteurs non-nucléosides de la transcriptase inverse sont d’importants agents antirétroviraux qui ont fortement diminué la morbidité et la mortalité des patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Il a récemment été démontré qu’il existe une relation entre les concentrations plasmatiques de ces agents et le réponse clinique. Le monitoring thérapeutique est dès lors une pratique potentiellement intéressante pour maximiser l’efficacité et diminuer la toxicité de ces deux classes de médicaments.
Dans un premier temps, nous avons mis au point et validé une méthode de dosage par LC-MS/MS (chromatographie liquide à haute performance couplée à un spectromètre de masse en tandem) pour la quantification simultanée de sept antirétroviraux : cinq inhibiteurs de la protéase (atazanavir, saquinavir, lopinavir, ritonavir et tipranavir) et deux inhibiteurs non-nucléosides de la transcriptase inverse (névirapine et éfavirenz). La méthode, dont le temps d’analyse est de 10 minutes, a été validée sur une gamme d’étalonnage allant de 10 à 500 ng/ml. Les limites de détection et de quantification varient de 6.5 à 41.1 ng/ml, sauf pour l’éfavirenz et le tipranavir pour lesquels les valeurs sont un peu plus élevées.
Dans un deuxième temps, dans le but de mieux comprendre l’origine de la grande variabilité interindividuelle dans la pharmacocinétique de ces substance, nous avons testé l’implication éventuelle de la P-glycoprotéine (P-gp) dans leur transport transmembranaire. Cette étude a été réalisée grâce à deux modèles : le modèle in vitro des cellules Caco-2 et le modèle in vivo des souris KO, déficientes pour le gène de la P-gp. Les expériences in vitro ont montré que tous les inhibiteurs de la protéase testés sont substrats de la P-gp. De manière intéressante, il semble que l’atazanavir possède la plus grande affinité pour la protéine de transport et cette substance pourrait donc être utilisée comme modèle à l’avenir pour la protéine de transport et cette substance pourrait donc être utilisée comme modèle à l’avenir pour vérifier l’impact fonctionnel des polymorphismes génétiques de la P-gp. A l’inverse, les inhibiteurs non-nucléosides de la transcriptase inverse ne semblent pas être des substrats de la P-gp. Les résultats des études in vivo sont peu concluants seuls ceux de la névirapine ont confirmé les résultats déjà obtenus par le modèle in vitro.
En conclusion, ce travail offre la possibilité de doser sept agents antirétroviraux aux cours d’une même analyse et ouvre la porte à des investigations de type pharmacogénétique pour les inhibiteurs de la protéase en général et plus particulièrement pour l’atazanavir

Chromatography, Liquid --- Mass Spectrometry --- P-Glycoprotein --- Anti-Retroviral Agents