Abstract | Keywords | Export | Availability | Bookmark

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

De bestrijding van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV), wat het verworven immunodeficiëntie syndroom (AIDS) veroorzaakt, blijft een enorme uitdaging op wereldniveau. Momenteel zijn er wereldwijd meer dan 30 miljoen personen geïnfecteerd met HIV. Sinds de eerste rapporteringen van HIV infecties in 1981 zijn er al meer dan 25 miljoen mensen gestorven aan AIDS. Doordat het virus een korte replicatiecyclus heeft en bovendien veel fouten maakt in zijn genoom, kan het snel muteren. Dit heeft tot gevolg dat virussen ontstaan die ongevoelig zijn aan de huidige therapie. Ondanks het feit dat de huidige behandeling voor HIV geïnfecteerde patiënten gebaseerd is op combinaties van zeer effectieve antiretrovirale middelen, blijven er toch resistente virusstammen ontstaan. Dit betekent dat wetenschappers continu op zoek moeten naar nieuwe inhibitoren die de resistente virussen kunnen bestrijden. Daarom werken deze nieuwe producten liefst tegen stappen van de replicatiecyclus waarvoor nog geen inhibitoren op de markt zijn. HIV zelf heeft slechts een zeer beperkte genomische capaciteit. Om toch zijn replicatiecyclus efficiënt te kunnen voltooien, heeft HIV strategieën ontwikkeld waarbij het gebruik maakt van humane eiwitten, welke cofactoren genoemd worden. De binding van virale aan humane eiwitten opent perspectieven voor de ontwikkeling van een nieuw prototype van inhibitoren: de cofactor remmers. De focus in ons laboratorium ligt op de interactie van het essentiële virale enzym HIV-1 integrase met zijn humane cofactor LEDGF/p75. Wij willen voornamelijk het therapeutisch potentieel van deze belangrijke associatie nagaan. Omdat niet alle retrovirussen dezelfde strategie volgen om tot een succesvolle infectie te komen, was een eerste doelstelling van dit werk het karakteriseren van de specificiteit van de associatie van de twee eiwitten. We hebben aangetoond dat LEDGF/p75 niet alleen bindt met het integrase van HIV type 1, maar ook met andere lentivirale integrases zoals dat van HIV type 2 en “feline immunodeficiency virus”. Er werd echter geen binding gezien met de integrases van oncoretrovirussen zoals “Moloney murine leukemia virus” (MoMLV). Deze resultaten toonden aan dat niet alle retrovirussen dezelfde strategie gekozen hebben om een cofactor te selecteren. Bovendien maakten ze duidelijk dat de binding van integrase met LEDGF/p75 enkel optreedt bij lentivirussen, zoals HIV. Om inzicht te krijgen in het werkingsmechanisme van LEDGF/p75 en zijn rol in de HIV integratie, hebben we gebruik gemaakt van fluorescentie correlatie spectroscopie. We toonden aan dat de affiniteit van integrase voor DNA dramatisch verhoogd wordt door LEDGF/p75 op een lentiviraal-specifieke manier. Deze bevindingen werden bovendien verder uitgewerkt met behulp van AlphaScreen technologie. Blijkbaar speelt LEDGF/p75 meerdere rollen in de vorming van het integrase-DNA complex. Terwijl het volledige eiwit de binding kan stimuleren, wordt deze associatie geïnhibeerd door C-terminale fragmenten van LEDGF/p75 die het domein bevatten dat verantwoordelijk is voor de binding met integrase, maar die geen DNA-bindende eigenschappen hebben. Deze resultaten suggereren dat kleine moleculen die interfereren met de integrase-LEDGF/p75 binding, meerdere effecten kunnen hebben als therapeutica. Ze beïnvloeden niet alleen de directe binding van de twee eiwitten, maar kunnen ook een effect uitoefenen op de enzymatische activiteit van integrase. Met het oog op de ontwikkeling van nieuwe antivirale producten is het belangrijk om over structurele informatie van het integrase-LEDGF/p75 complex te beschikken. Door een mutagenesestudie uit te voeren hebben we de aminozuren in integrase kunnen bepalen die verantwoordelijk zijn voor de binding met LEDGF/p75. Eén regio is gelegen rond de aminozuren W131 en W132, terwijl het tweede gebied zich uitstrekt van aminozuur I161 tot E170. Vervolgens kon een structuur-functie analyse aantonen dat een virus met de W131A mutatie in integrase een verminderde replicatiecapaciteit vertoont. Daarentegen is een virus met de Q168A mutatie volledig replicatiedeficiënt. Bovendien was het geobserveerde defect in replicatie te wijten aan een geblokkeerde integratie. Deze data hebben daardoor niet alleen bijgedragen aan de verdere validatie van LEDGF/p75 als belangrijke cofactor voor virale replicatie, maar hebben ook de structuur van het integrase-LEDGF/p75 complex verhelderd. De belangrijkste functie van LEDGF/p75 tijdens de replicatiecyclus is het richten van de binnenkomende virale partikels naar transcriptioneel actieve gebieden in het gastheergenoom, waardoor de integratie en infectie bevorderd wordt. Bovendien weten we dat lenti- en oncoretrovirussen verschillende regio’s in het genoom verkiezen voor hun integratie en dat LEDGF/p75 een lentiviraal-specifieke cofactor is. Daarom zijn we een zoektocht gestart naar de oncoretrovirale tegenhanger van LEDGF/p75. We hebben grootschalige immunozuiveringen uitgevoerd, die gevolgd werden door de identificatie van de gezuiverde eiwitten met massaspectrometrie. Zo hebben we meerdere mogelijke bindingspartners van MoMLV integrase kunnen identificeren. De functie van één veelbelovende bindingspartner werd verder onderzocht gebruik makend van zowel transiënte als stabiele RNA interferentie. Hoewel we nog geen essentiële rol als cofactor voor oncoretrovirale integratie konden aantonen, hebben we wel de nucleaire colokalisatie van MoMLV integrase en zijn cellulaire bindingspartner vastgesteld. Verder onderzoek zal moeten uitmaken of dit cellulaire eiwit gevalideerd kan worden als een oncoretrovirale cofactor die verantwoordelijk is voor het richten van de virale partikels naar specifieke plaatsen in het genoom. Combating human immunodeficiency virus (HIV), the causative agent of the acquired immune deficiency syndrome (AIDS), remains an urgent global challenge. More than 30 million individuals are currently infected worldwide. Since the report of the first outbreak of the virus in 1981, more than 25 million people have died of AIDS. Because of its short replication cycle and high-error rate, HIV mutates very quickly resulting in the rapid emergence of drug resistant HIV strains. Although the current treatment for HIV infected patients, called highly active antiretroviral therapy (HAART), is based on combinations of potent antiretrovirals, the emergence of drug resistant virus strains urges scientists to constantly look for novel inhibitors to outpace resistance development. Preferentially, these new drugs target yet unexploited steps of the viral replication cycle. HIV itself has only limited genomic capacity and it hijacks cellular proteins (the so-called cofactors) to efficiently complete its replication cycle. These interactions between viral and host proteins represent unique opportunities for the development of a new class of specific drugs: cofactor blockers. Our laboratory focuses on the interaction between the essential viral enzyme HIV-1 integrase and the cellular cofactor LEDGF/p75. More in particular we investigate the therapeutic potential of this important association. As different retroviruses have evolved various strategies for successful infection, a first part of this thesis aimed at characterizing the specificity of the interaction between the two proteins. We showed that LEDGF/p75 could not only interact with the integrase of HIV type 1, but also with other lentiviral integrases including HIV type 2 and feline immunodeficiency virus. On the contrary, no interaction was observed with integrases of oncoretroviruses like Moloney murine leukemia virus (MoMLV). These results indicated that not all retroviruses have adopted the same strategy for cofactor selection and that the interaction between integrase and LEDGF/p75 is restricted to lentiviruses, such as HIV. To gain insight in the mechanism of action of LEDGF/p75 and its role in HIV integration, we have used fluorescence correlation spectroscopy to show that LEDGF/p75 dramatically increases the binding affinity of integrase for DNA in a lentiviral-specific manner. These findings were further corroborated in more depth using AlphaScreen technology. LEDGF/p75 appears to have multiple functions in the integrase-DNA complex formation. Whereas the full-length protein potently stimulates the interaction, C-terminal fragments of LEDGF/p75 that harbour the domain responsible for binding to integrase but lack DNA binding capacity, inhibit integrase DNA interaction. These results suggest that small molecules interfering with the LEDGF/p75-integrase interaction could have multiple effects as therapeutics, affecting not only the direct interaction of the two proteins, but also indirectly interfering with the enzymatic activity of integrase. To embark on drug discovery, structural information on the integrase-LEDGF/p75 protein complex is warranted. Using a mutagenesis approach, we could corroborate the amino acids in integrase that are responsible for interaction with LEDGF/p75. One region centered around residues W131 and W132 while the second extended from amino acid I161 up to E170. A structure-function analysis furthermore revealed that a virus containing the W131A mutation in integrase displayed reduced replication capacity, while virus carrying integrase with a Q168A mutation is replication defective. The observed replication defect was due to a block of integration. These data not only contributed to the further validation of LEDGF/p75 as important cofactor for viral replication, but also shed light on the structure of the integrase-LEDGF/p75 complex. The main function of LEDGF/p75 during the replication cycle is the tethering of incoming viral particles to transcriptionally active regions in the host genome, promoting efficient integration and infection. As we know that lenti- and oncoretroviruses have differential target site preference and because LEDGF/p75 is a lentiviral-specific cofactor, we initiated a search for the oncoretroviral counterpart of LEDGF/p75. Using large-scale immunopurification and subsequent identification by mass spectrometry, we were able to identify several putative binding partners of MoMLV integrase. The function of one promising interaction partner was further investigated using both transient and stable RNA interference technology. Although a role as an essential cofactor for oncoretroviral integration could not be demonstrated yet, nuclear colocalization of both MoMLV integrase and the cellular binding partner was observed. Further research might validate this cellular protein as an oncoretroviral tethering factor. bindt met het integrase van HIV type 1, maar ook met andere lentivirale integrases zoals dat van HIV type 2 en “feline immunodeficiency virus”. Er werd echter geen binding gezien met de integrases van oncoretrovirussen zoals “Moloney murine leukemia virus” (MoMLV). Deze resultaten toonden aan dat niet alle retrovirussen dezelfde strategie gekozen hebben om een cofactor te selecteren. Bovendien maakten ze duidelijk dat de binding van integrase met LEDGF/p75 enkel optreedt bij lentivirussen, zoals HIV. Om inzicht te krijgen in het werkingsmechanisme van LEDGF/p75 en zijn rol in de HIV integratie, hebben we gebruik gemaakt van fluorescentie correlatie spectroscopie. We toonden aan dat de affiniteit van integrase voor DNA dramatisch verhoogd wordt door LEDGF/p75 op een lentiviraal-specifieke manier. Deze bevindingen werden bovendien verder uitgewerkt met behulp van AlphaScreen technologie. Door een mutagenesestudie uit te voeren hebben we de aminozuren in integrase kunnen bepalen die verantwoordelijk zijn voor de binding met LEDGF/p75. Deze data hebben daardoor niet alleen bijgedragen aan de verdere validatie van LEDGF/p75 als belangrijke cofactor voor virale replicatie, maar hebben ook de structuur van het integrase-LEDGF/p75 complex verhelderd. De belangrijkste functie van LEDGF/p75 tijdens de replicatiecyclus is het richten van de binnenkomende virale partikels naar transcriptioneel actieve gebieden in het gastheergenoom, waardoor de integratie en infectie bevorderd wordt. Bovendien weten we dat lenti- en oncoretrovirussen verschillende regio’s in het genoom verkiezen voor hun integratie en dat LEDGF/p75 een lentiviraal-specifieke cofactor is. Daarom zijn we tevens een zoektocht gestart naar de oncoretrovirale tegenhanger van LEDGF/p75. We hebben grootschalige immunozuiveringen uitgevoerd, die gevolgd werden door de identificatie van de gezuiverde eiwitten met massaspectrometrie. Zo hebben we meerdere mogelijke bindingspartners van MoMLV integrase kunnen identificeren. De functie van één veelbelovende bindingspartner werd verder onderzocht gebruik makend van zowel transiënte als stabiele RNA interferentie. Verder onderzoek zal moeten uitmaken of dit cellulaire eiwit gevalideerd kan worden als een oncoretrovirale cofactor die verantwoordelijk is voor het richten van de virale partikels naar specifieke plaatsen in het genoom. Combating human immunodeficiency virus (HIV), the causative agent of the acquired immune deficiency syndrome (AIDS), remains an urgent global challenge. More than 30 million individuals are currently infected worldwide. Since the report of the first outbreak of the virus in 1981, more than 25 million people have died of AIDS. Because of its short replication cycle and high-error rate, HIV mutates very quickly resulting in the rapid emergence of drug resistant HIV strains. Although the current treatment for HIV infected patients, called highly active antiretroviral therapy (HAART), is based on combinations of potent antiretrovirals, the emergence of drug resistant virus strains urges scientists to constantly look for novel inhibitors to outpace resistance development. Preferentially, these new drugs target yet unexploited steps of the viral replication cycle. HIV itself has only limited genomic capacity and it hijacks cellular proteins (the so-called cofactors) to efficiently complete its replication cycle. These interactions between viral and host proteins represent unique opportunities for the development of a new class of specific drugs: cofactor blockers. Our laboratory focuses on the interaction between the essential viral enzyme HIV-1 integrase and the cellular cofactor LEDGF/p75. More in particular we investigate the therapeutic potential of this important association. As different retroviruses have evolved various strategies for successful infection, a first part of this thesis aimed at characterizing the specificity of the interaction between the two proteins. We showed that LEDGF/p75 could not only interact with the integrase of HIV type 1, but also with other lentiviral integrases including HIV type 2 and feline immunodeficiency virus. On the contrary, no interaction was observed with integrases of oncoretroviruses like Moloney murine leukemia virus (MoMLV).