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2-Choro-2’-deoxyadenosine (CdA) is a nucleoside analogue used in the treatment of B-cell chronic lymphocytic leukaemia (B-CLL). The active metabolite of this compound is the triphosphate derivative CdATP. Accumulation of CdATP inside lymphocytes results in an inhibition of DNA synthesis (replication and repair), leading to apoposis.
In the leukaemia EHEB cell line derived from B-CLL lymphocytes, an unexpected effect of CdA has been observed. Indeed, in this cell line, CdA induces apoptosis at concentrations that do not inhibit, but rather increase DNA synthesis. This paradoxical effect of CdA on DNA synthesis is due to an increase of the number of cells in S phase of the cell cucle, which can be explained by a stimulation of the progression of cells from G1 to S phase.
In eukaryotes, cell cycle progression is coordinated by several protein kinases: the cyclin-dependent kinases (CdKs). Among them, CdK-2 plays a crucial role in the G1/S transition, and hence could be involved in the CdA-induced stimulation of S-phase entry. Therefore, the first objective of my study was to settle the assay for CdK-2 activity, based on the phosphorylation of histone H1, one of its substrates, in the presence of [γ32P] ATP. Two different techniques were used for the measurement of histone H1 radioactivity. Both methods gave a similar result, that is CdA indeed increases CdK-2 activity in EHEB cells. An increase of expression of CdK-2 protein was also observed upon incubation with CdA.
The second objective of my work was to investigate whether the activation of CdK-2 plays role in apoptosis induced by CdA. To answer to this question, we analysed the effect of CdK-2 inhibitors on the activation of caspase-3, a hallmark of apoptosis. We observed that two different CdK-2 inhibitors decreased the activation of caspase-3 induced by CdA, indicating that activation of CdK-2 is involved in CdA induced apoptosis in EHEB cells. Such a role of CdK-2 had already been observed, in other models, but never in response to a purine analogue La 2-chloro-2’-désoxyadénosine (CdA) est un analogue de la 2’-désoxyadénosine, utilisé dans le traitement de la leucémie lymphoïde chronique de type B (LLC-B). Le métabolite actif de cette molécule est le CdATP. Son accumulation dans les lymphocytes provoque une inhibition de la synthèse d’ADN (réplication et réparation), ce qui mène à l’apoptose.
Dans la lignée leucémique EHEB, une lignée établie à partir des lymphocytes d’un patient atteint de LLC-B, un effet de la CdA tout a fait inattendu a été observé. En effet, dans cette lignée, la CdA induit l’apoptose à des concentrations auxquelles la synthèse d’ADN est, non pas inhibée, mais stimulée. Cet effet de la CdA sur la synthèse d’ADN est dû à une augmentation du nombre de cellules en phase S du cycle cellulaire, qui s’explique par une stimulation du passage des cellules de la phase G1 vers la phase S.
La succession des différentes phases du cycle cellulaire se fait sous le contrôle de différentes protéines kinases : les kinases cycline-dépendantes ou CdKs. Parmi celle-ci, la CdK-2 joue un rôle crucial dans la transmission G1/S, et elle pourrait être impliquée dans la stimulation par la CdA de l’entrée des cellules en phase S. C’est pourquoi le premier objectif de mon mémoire fut de mettre au point la mesure de l’activité de cette enzyme en présence de [γ32P] ATP et d’histoire H1, un des substrats de cette enzyme. Nous avons utilisé deux techniques différentes pour la mesure de l’histoire H1 radioactive, et les deux techniques nous donnent le même genre de résultat, à savoir que l’activité de la CdK-21 est augmentée dans des cellules incubées en présence de CdA. Nous avons également observé que la CdA induit une augmentation de l’expression de cette enzyme.
Nous avons poursuivi notre travail en recherchant si cette activation de la CdK-2 jouait un rôle dans l’apoptose induite par la CdA. Pour répondre à cette question, nous avons testé l’effet d’inhibiteurs de la CdK-2 sur l’activité de la caspasse-3, une enzyme dont l’cativation est un critère d’apoptose. Nous avons observé que deux inhibiteurs différents de la CdK-2 parviennet à diminuer l’activation de la caspase-3 induite par la CdA, ce qui indique que l’activation de la CdA favorise l’apoptose dans les cellules EHEB. Un tel rôle de la Cdk-2 dans l’apoptose avait déjà été observé, dans d’autres modèles cellulaires et en réponse à divers agents apoptotiques, mais jamais en réponse à la CdA

Cladribine --- Cyclin-Dependent Kinases --- Leukemia --- Apoptosis