Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

In this thesis, fundamental research was performed to the phase behavior of certain water-soluble polymers, based on Poly Vinyl Methyl Ether (PVME), which are characterized by a very peculiar type III bimodal LCST. This PVME was synthesized via a special strategy. Not only PVME but also copolymers of PVME with Vinyl Alcohol (VA) and Vinyl Acetate (VAc), in two different chemical compositions were formed in a similar way to investigate the influence of, respectively, hydrophilic/hydrophobic interactions with the solvent. The synthesis of the (co)polymers was done in several steps, where the first step was the synthesis of Poly Vinyl Acetate (PVAc) via the, rather uncommon, Cobalt-Mediated Radical Polymerization (CMRP) of VAc. Well-defined PVAc chains were able to be formed via this polymerization reaction, with different molar masses and a low polydispersity (Đ). In a next step, a Side Chain Modification Reaction, a methylation reaction to be more specific, was performed on this PVAc to obtain copolymers of Vinyl Methyl Ether (VME) with VA, in a composition of 93% VME and 7% VA, more or less. Higher methylation values were obtained by performing the same reaction again, in the presence of a stronger base, by which a copolymer of 96% VME and 4% VA, and a 100% PVME polymer were formed. In a final step, the alcohol functions in the copolymer were acetylated via a so-called DMAP catalyzed acetylation reaction, in which copolymers of the same compositions and characteristics were formed, and only the VA group was substituted by a VAc group. Proton Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR) and Size Exclusion Chromatograhy (SEC) techniques were used to characterize these polymers in their synthetic procedures. Eventually, the LCST phase behavior of these (co)polymers was examined, together with the influence of the other functional groups than VME. Differential Scanning Calorimetry (DSC) and Optical Microscopy (OM) were used for examination of the phase behavior of the products, in a 5% w/w aqueous solution. During the synthetic steps, salts were formed, which were removed as much as possible and the final amounts of salts that could not be removed were measured via Inductive Coupled Plasma (ICP-OES).

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Simulations of atoms and molecules have a very wide range of applications. They’re used to study complicated biological processes and to design fantastic new materials such as self-healing plastics. Atoms, however, are very small and move rapidly. As a result, atomistic simulations require a lot of time. Say for example, that a scientist would like to simulate a human cell down to every last atom, for one second. Even a supercomputer would require millions of years to perform all the necessary calculations. For this reason, every possible technique for accelerating atomistic simulations is very valuable. It comes as no surprise then, that many techniques already exist. They are mostly focused on dealing with simple systems however, that are made of a single material that is nearly the same everywhere. Such systems are called homogeneous and their counterparts are heterogeneous systems. A system may be made heterogeneous by introducing a solid interface, that attracts a liquid material. This will cause the material to stick together and achieve a higher density near the interface. Therefore, the material is no longer homogeneous, since it is no longer the same everywhere. The work presented here serves as a basis to generalize well-known techniques for acceleration, such as coarse-graining, so that they may be used for heterogeneous systems. The basic idea of coarse-graining is to represent small groups of atoms by beads, letting them interact in an artificial way so that they effectively behave in the same way as the original groups of atoms they represent. This artificial interaction depends on the density of the material, so that it cannot simply be applied to a heterogeneous system. One technique for simplification that was shown to work reliably involves representing the interface by an external potential. The simplified explanation of this is that in stead of calculating every force from every interaction with every particle in the interface, only a single average force is calculated for each liquid particle. A simple technique was set up to calculate such a potential, namely by simulating an ideal gas next to the interface and deriving the potential from the resulting density profile. In this context, an ideal gas refers to particles that interact with the interface, but not with each other. The new technique was subsequently applied to more complex, realistic, heterogeneous systems in order to check if the results remain consistent. This was indeed the case. After successfully simplifying the interface, the next step was to simplify the simulated molecules themselves. A technique for coarse-graining homogeneous materials was applied to the same heterogeneous systems, with the goal of determining what kind of problems occur, and possibly finding solutions for them. The thesis was concluded with a perspective on a new adapted technique that may make coarse-graining for heterogeneous systems possible in the future.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Hogedrukstudie van amyloïdfibrillen In nagenoeg elk biologisch proces is de tussenkomst van gespecialiseerde eiwitten vereist. Synthese van proteïnen, transport van moleculen doorheen membranen, opslag van energie en katalyse van verschillende reacties: het zijn maar een aantal voorbeelden waarbij de tussenkomst van eiwitten noodzakelijk is. Voor het uitvoeren van deze verschillende taken is een diversiteit in structuur vereist. Eiwitten zijn lineaire biopolymeren die opgebouwd zijn uit aminozuren. Deze aminozuren zijn aan elkaar gelinkt door middel van een peptidebinding. Een verschil in lengte en samenstelling van deze aminozuren bij verschillende proteïnen geeft aanleiding tot andere structuren. Hieruit blijkt dat een correcte vouwing van het eiwit noodzakelijk is om zijn functie naar behoren te kunnen uitoefenen. Een verkeerde vouwing van het eiwit kan leiden tot een eiwit dat niet langer functioneel is of tot een aggregaat (Dobson, 2003). Het neerslaan van deze geaggregeerde eiwitten, de zogenaamde amyloïdfibrillen, is één van de kenmerken van een aantal moleculaire ziektes, zoals bijvoorbeeld de ziekte van Alzheimer en spongiforme encefalopathie bij runderen (BSE). Ondanks het feit dat ze uit verschillende eiwitten gevormd kunnen worden, hebben deze amyloïdfibrillen toch een groot aantal gemeenschappelijke kenmerken, zoals de b-kruisstructuur (Serpell et al., 1997), kleuring met congorood (Westermark et al., 1999), verhoogde fluorescentie van thioflavine T (Le Vine, 1997) en een opmerkelijke resistentie ten opzichte van proteases. De precieze driedimensionale structuur van de amyloïdfibrillen is nog niet opgehelderd. Dit heeft twee redenen: (i) X-stralenkristallografie is niet mogelijk omdat men geen kristallen kan maken van de amyloïdfibrillen en (ii) omwille van de onoplosbaarheid van de fibrillen is het bepalen van de structuur met kernmagnetische resonantie (NMR) in oplossing ook geen optie. Er werden reeds verschillende modellen voorgesteld die proberen de driedimensionale structuur van de amyloïdfibrillen te beschrijven. Eén hiervan is de parallelle b-helix (Wetzel, 2002). Een aantal eiwitten, zoals de pectinases, nemen van nature deze parallelle b-helix als conformatie aan (Jenkins & Pickersgill, 2001). Onze aanpak om meer informatie te vergaren over de interacties die belangrijk zijn tijdens de vorming van de fibrillen en over eventuele caviteiten in de driedimensionele structuur van de amyloïdfibrillen, bestaat uit het gebruik van hoge hydrostatische druk. Dit kan op verschillende manieren: (i) De stabiliteit van de amyloïdfibrillen onder hoge druk kan worden getest. (ii) De invloed van een hogedrukbehandeling op de fibrillogenese kan worden nagaan. (iii) Het proces van amyloïdfibrilvorming kan onder druk gevolgd worden. (iv) De stabiliteit onder hoge druk van pectinemethylesterase (PME), een enzym dat als natieve conformatie de parallelle b-helix aanneemt, kan onderzocht en vergeleken worden met de stabiliteit van amyloïdfibrillen. De twee gebruikte technieken in deze studie zijn Fouriergetransformeerde infraroodspectroscopie (FTIR-spectroscopie) en atomairekrachtmicroscopie (AFM). FTIR-spectroscopie biedt enerzijds de mogelijkheid om de secundaire structuur van eiwitten te achterhalen en met behulp van de diamantaambeeldcel (DAC) kunnen drukgeïnduceerde veranderingen in situ gevolgd worden tot 1,5 GPa. AFM geeft anderzijds informatie over de morfologie van de aggregaten in functie van de tijd of na drukbehandeling. Ook andere eiwitten die niet met een ziektebeeld geassocieerd zijn, zoals bijvoorbeeld insuline, kunnen amyloïdfibrillen vormen. Dit suggereert dat de eigenschap om deze fibrillen te vormen algemeen is. In hoofdstuk 5 werd de fibrilvorming van het wildtype (WT)-insuline onderzocht en vergeleken met dat van twee mutanten, nl. despentapeptide-insuline (DPI) en des-(B1,B2)-insuline. Bij DPI zijn er vijf aminozuren aan het carboxyluiteinde van de B-keten verwijderd, bij des-(B1,B2)-insuline werden twee aminozuren aan de N-terminus van diezelfde keten weggehaald. De fibrilvorming bij WT-insuline, DPI en des-(B1,B2) was gelijkaardig, op enkele kleine verschillen na. De band die karakteristiek is voor de b-vouwbladstructuur heeft een kleine roodverschuiving ondergaan in het IR-spectrum van de mutanten. Ook op het vlak van morfologie kan men opmerken dat er bij de fibrillen van WT-insuline een helicale draaiing terug te vinden is, maar niet bij de fibrillen van de insulinemutanten. Eerder al werd gepoogd een correlatie te vinden tussen de positie van de band die duidt op b-vouwbladstructuur en de verschillende morfologie, maar deze bleek niet te kloppen (Nielsen-Garriques et al., 2002). Drukbehandeling van de WT-insulinefibrillen tot 1 GPa leverde enkel maar kleine veranderingen op in het spectrum. We konden echter geen ontvouwing van de fibrillen waarnemen. De drukstabiliteit van de fibrillen gevormd door de insulinemutanten was gelijkaardig. Om meer inzicht te krijgen in de veranderingen die onder druk gebeuren, werd de waterstof/deuterium (H/D)-uitwisseling gevolgd onder druk. Dit experiment maakte duidelijk dat er zelfs onder hoge druk geen volledige uitwisseling van protonen tegen deuteronen plaatsvond. Hieruit kunnen we besluiten dat de insulinefibrillen op zijn minst een kern moeten hebben die niet toegankelijk is voor het solvent, zelfs niet onder hoge druk. Een mogelijke verklaring voor de kleine veranderingen die werden waargenomen in het IR-spectrum, is dat de protofilamenten waaruit fibrillen bestaan, uit elkaar gaan, waarbij een kern van b-vouwbladstructuur behouden blijft. Al deze veranderingen onder druk waren omkeerbaar, zoals bleek uit het IR-spectrum bij atmosferische druk en de AFM-beelden na drukbehandeling. Deze resultaten zetten er ons toe aan om een ander amyloïdsysteem onder druk te bestuderen. Transthyretine105-115-peptide (TTR105-115), de b-streng G in transthyretine, werd bestudeerd in hoofdstuk 6. Van dit peptide was reeds aangetoond dat men er in vitro vlot fibrillen van kan maken (Gustavsson et al., 1991). De fibrilvorming bij TTR105-115 gaat trager dan bij insuline, wat de mogelijkheid biedt om de drukstabiliteit op verschillende momenten in het proces te onderzoeken. Na één dag is er in het spectrum van TTR105-115 een smalle band bij 1624 cm-1 (b-vouwbladstructuur) op te merken, maar ook nog enkele andere banden, die bijdragen zijn van bochtstructuren en ongeordende structuren. Op de AFM-beelden kunnen we zien dat er in dit stadium zowel fibrillair als amorf materiaal aanwezig is. De hogedrukstudie toonde aan dat deze vroege aggregaten reeds bij een druk van ~200 MPa gedissocieerd kunnen worden. Na een incubatie van vier dagen ligt het maximum van de amide I’-band uitgesproken bij 1624 cm-1. Op dat tijdstip zijn op de AFM-beelden mature amyloïdfibrillen waar te nemen. Het IR-spectrum en de morfologie van TTR105-115 lijken op die van insuline. Hogedrukbehandeling tot 1,2 GPa was niet voldoende om enige verandering in het IR-spectrum van de mature TTR105-115-fibrillen te induceren. Zelfs een combinatie van hoge druk en hoge temperatuur slaagde er niet in om het b-vouwbladgehalte te verminderen. Deze resultaten zijn in strijd met de drukdestabilisatie die gevonden werd voor TTR zelf en a-synucleïne (Foguel et al., 2003). De amyloïdfibrillen van deze eiwitten konden beide gedissocieerd worden bij een druk van ~200-300 MPa. Blijkbaar hebben de fibrillen gevormd door verschillende proteïnen of peptiden niet dezelfde drukstabiliteit. Een verklaring hiervoor zouden we kunnen vinden door te veronderstellen dat de fibrillen onderzocht door Foguel et al. (2003) slechts vroege aggregaten waren en nog geen mature fibrillen. De drukinstabiliteit die gevonden werd voor de vroege aggregaten van TTR105­115 wijst erop dat in het vroege stadium van de fibrilvorming vooral hydrofobe en elektrostatische interacties, die tegengewerkt worden door druk, een belangrijke rol spelen. In een later stadium kunnen we de drukstabiliteit van de mature fibrillen verklaren door het hechte waterstofbruggennetwerk dat gevormd wordt en de afwezigheid van caviteiten. Er werd na de drukbehandeling van de vroege aggregaten van TTR105-115 reeds opgemerkt dat de intensiteit van de band bij 1624 cm-1, die wijst op b-vouwbladstructuur, was gestegen. Dit suggereert dat door de drukbehandeling meer fibrillen gevormd werden. In hoofdstuk 7 bestuderen we de eigenschappen van deze drukgeïnduceerde fibrillen. AFM-beelden genomen voor en na de drukbehandeling toonden inderdaad een verhoogde opbrengst aan fibrillen aan. Deze drukgeïnduceerde fibrillen hadden dezelfde morfologie en IR-spectrum als de fibrillen die gevormd werden bij atmosferische druk. Als we echter naar hun drukstabiliteit kijken, dan zien we dat deze drukgeïnduceerde fibrillen deze stabiliteit nog niet verworven hadden, maar het toepassen van meerdere cycli verhoogde wel hun drukstabiliteit. Deze hogere opbrengst aan fibrillen lijkt erop te wijzen dat drukbehandeling een kleine verandering induceert in de conformatie. Deze gewijzigde conformatie heeft een grotere neiging tot fibrilvorming. Andere verklaringen zijn dat drukbehandeling meer nuclei induceert of dat intermediairen, die niet naar fibrilvorming leiden, gedissocieerd worden door hoge druk. Meer informatie over de drijvende kracht achter de fibrilvorming van TTR105-115 en insuline kan verkregen worden door deze te volgen bij relatief lage druk (~100-120 MPa). Hierbij vonden we dat de fibrillogenese bij TTR105­115 vertraagd werd; de fibrilvorming bij insuline daarentegen werd volledig geïnhibeerd. Voor insuline kan de verklaring voor de volledige inhibitie gezocht worden in het feit dat de combinatie hoge temperatuur (nodig voor fibrilvorming) en druk zorgde voor een volledig ontvouwen conformatie van insuline. Deze conformatie is vermoedelijk te sterk ontvouwen om nog aanleiding te geven tot fibrillen. Anderzijds kan het zijn dat hydrofobe en elektrostatische interacties zo belangrijk zijn bij de eerste stappen van fibrilvorming van insuline, dat het tegenwerken hiervan door de drukverhoging het proces volledig inhibeert. Voor TTR105-115 blijken daarentegen zowel waterstofbrugvorming als hydrofobe interacties een rol te spelen in het vroege stadium van fibrilvorming, gezien het proces enkel vertraagd maar niet geïnhibeerd werd. De belangrijke rol van de waterstoffen in dit stadium werd bevestigd door een moleculairedynamicastudie op dit peptide (Paci et al., 2004). In hoofdstuk 8 werd tenslotte de drukstabiliteit van de mature fibrillen vergeleken met die van PME van Aspergillus aculeatus. Voor dit enzym werd reeds eerder aangetoond dat er geen drukinactivatie bekomen kon worden na behandeling bij 700 MPa (Duvetter et al., 2005). Gezien de natieve conformatie van PME de parallelle b-helix, één van de voorgestelde modellen voor de opbouw van de amyloïdfibrillen, is, zouden deze structuren wel eens gelijkaardig kunnen zijn. Hogedrukbehandeling tot 1 GPa leidde niet tot ontvouwing van de conformatie van PME. Boven 1 GPa namen we wel veranderingen waar in het IR-spectrum die duiden op ontvouwing. Hieruit kunnen we besluiten dat de druk die nodig is om PME te ontvouwen (1 GPa), hoger ligt dan voor de meeste eiwitten en dus van dezelfde grootteorde is als de drukstabiliteit van de mature TTR105-115-fibrillen. De hoge drukstabiliteit van de b-helices kan verklaard worden door het hechte waterstofbruggennetwerk, de afwezigheid van caviteiten en de verticale stapeling van alifatische en aromatische aminozuurresiduen in de b-helix. Terwijl mature fibrillen ook stabiel zijn bij hoge temperaturen, wordt deze eigenschap niet teruggevonden bij PME. De ontvouwings- en ook inactivatietemperatuur voor dit enzym ligt bij ~55°C (Duvetter et al., 2005). Dit wijst erop dat er toch nog een verschil moet zijn tussen natieve parallelle b-helices en amyloïdfibrillen, wat er voor zorgt dat deze laatsten zowel stabiel zijn bij hoge druk als bij hoge temperatuur. Een hogere dehydratatiegraad van de amyloïdfibril is een mogelijke verklaring hiervoor. We kunnen hieruit besluiten dat het gebruik van hoge druk veel mogelijkheden biedt om informatie te verkrijgen over de structuur van amyloïdfibrillen en de verschillende interacties die een rol spelen tijdens de fibrilvorming. Het is zelfs mogelijk om de fibrilvorming van TTR105-115 enerzijds te vertragen onder druk, anderzijds werd een verhoogde opbrengst aan fibrillen verkregen na hogedrukbehandeling. Een snellere en hogere productie van amyloïdfibrillen biedt de mogelijkheid om geneesmiddelen voor amyloïdziekten efficiënter te testen. High pressure as a tool to investigate amyloid fibrils The specialised function of proteins is required in nearly every biological process. The production of other proteins, transport of different molecules through membranes, storage of energy and catalysis of different reactions are only some of the actions in which the involvement of proteins is essential. This diversity in tasks also calls for a variety in structure. Proteins are all linear biopolymers consisting of amino acids connected by peptide bonds, but differ in length and amino-acid composition, giving rise to distinct conformations. Correct folding is thus necessary for proteins to execute their job. Misfolding of proteins can lead to an unfunctional protein and/or aggregation (Dobson, 2003). Deposition of aggregated proteins, the so-called amyloid fibrils, is one of the hallmarks of several molecular diseases, such as Alzheimer’s disease and bovine spongiform encephalopathy (BSE). Amyloid fibrils formed by different proteins share some properties, such as the cross-b structure (Serpell et al., 1997), staining by congo red (Westermark et al., 1999), increase of thioflavin T fluorescence (Le Vine, 1997) and a remarkable stability towards proteases. However, the exact three-dimensional (3D) structure of the amyloid fibrils has not yet been elucidated, because high-resolution techniques such as X-ray crystallography and solution nuclear magnetic resonance (NMR) are impossible due to inability to crystallise the amyloid fibrils and their low solubility, respectively. Different models have been proposed for the 3D structure of the fibrils. One of them is the parallel b-helix (Wetzel, 2002). This conformation is also adopted as a native fold by some proteins, e.g. the pectinases (Jenkins & Pickersgill, 2001). Our approach to gain more information on the interactions important in amyloid fibril assembly and on the possible presence of cavities in the three-dimensional structure of amyloid fibrils was the use of high hydrostatic pressure (HHP). HHP can here be applied in different ways: (i) to test the stability of the amyloid fibrils, (ii) to investigate the influence of a HHP treatment on the process of fibril formation, (iii) to follow fibrillogenesis under pressure and (iv) to probe the pressure stability of pectin methylesterase, a native b-helical protein. The two applied techniques for this study are Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and atomic force microscopy (AFM). FTIR spectroscopy enables us to determine the secondary structures present in the protein and, in combination with the diamond anvil cell (DAC), pressure-induced changes up to 1.5 GPa can be followed in situ. Alternatively, AFM images provide information on the morphology of the aggregated species as a function of time, but also after HHP treatment. Other proteins, not associated with amyloid disease, such as insulin, have also been shown to form fibrils, suggesting that this is a generic property. In chapter 5, we investigated the assembly process of wild-type (WT) insulin fibrils and compared it with two of its mutants, despentapeptide insulin (DPI) and des-(B1,B2)-insulin. DPI lacks five amino acids at the carboxyl terminus of the B-chain, whereas in des-(B1,B2)-insulin two amino acids at the N-terminus in the same chain have been removed. Fibrillogenesis of WT insulin, DPI and des-(B1,B2)-insulin was quite similar, but showed some distinctions as well. A small red shift could be observed when comparing the IR spectrum of WT insulin with the spectra of DPI and des-(B1,B2)-insulin. There was also a small difference in morphology: whereas the diameter and the amount of fibrils of both WT and mutant fibrils were much alike, a helical winding could be seen for WT insulin fibrils, but was not observed in the case of the mutant insulin fibrils. It has been suggested that morphological differences are associated with small shifts of the IR band, indicative for b-sheet structure (Nielsen-Garriques et al., 2002), but the correlation was not found to be general. Pressurisation of the insulin fibrils up to 1 GPa revealed that only small spectral changes took place, but no unfolding. Pressure stability of the insulin mutant fibrils was found to be similar. Hydrogen/deuterium (H/D)-exchange experiments were performed on the insulin fibrils under pressure to gain more insight into the events occurring under pressure. They revealed that, even under HHP, no complete exchange of protons took place. These H/D-exchange results together with the pressure stability indicated that insulin fibrils have a solvent-inaccessible core, even under HHP. A possible explanation for the small spectral changes observed under pressure is the dissociation of the fibril into its protofilaments, thereby maintaining a core of b-structure. All changes under pressure appeared reversible, as had been shown by the recovered IR spectrum at atmospheric pressure and the AFM images made after HHP treatment. The results on the pressure stability of the insulin fibrils urged us to investigate another amyloid system under HHP. Transthyretin 105-115 peptide (TTR105-115), corresponding to b-strand G of the full-length TTR, was under study in chapter 6. This peptide has been shown to readily form amyloid fibrils in vitro (Gustavsson et al., 1991). The fibrillogenesis of TTR105-115 required a longer incubation period than insulin, providing the opportunity to study the stability at different time points. After one day, the spectrum of the TTR105-115 species exhibited a small band at 1624 cm-1, indicative for b-sheet structure, but also some other spectral contributions, such as turns and disordered structures, could

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Deze thesis is toegewijd aan de theoretische studie van tryptofaan rotameertoestanden in proteïnen en hun mogelijke implicaties voor het fluorescentieverval. Hiertoe maakten we voornamelijk gebruik van de efficiënte ‘replica exchange’ moleculaire dynamica simulatiemethode en varianten hiervan. Hoe beïnvloeden rotameerconformaties de tijdsgeresolveerde fluorescentie van tryptofaan in proteïnen? Een perspectief gebaseerd op moleculaire modellering en kwantumchemie. We bespraken de dynamica van tryptofaan-rotameren in de context van het niet-exponentieel fluorescentieverval in proteïnen. De centrale vraagstelling is: hoe beïnvloedt de conformationele heterogeniteit de tijdsevolutie van tryptofaan fluorescentie? Dit probleem werd hier bestudeerd vanuit het theoretisch perspectief. We gaven een overzicht van drie methoden van verschillend theoretisch niveau, draagwijdte en computationele vereisten. De Dead-end eliminatie methode is beperkt tot zijketen dynamica en voorziet in een efficiënte manier om de stabiele tryptofaan-rotameren te detecteren in een proteïne. De toepassing van deze methode op de studie van heterogene emissie-eigenschappen werd geïllustreerd. Moleculaire dynamica mikt op de volledige ‘phase space’ van de marcromolecule in oplossing, maar moet steunen op klassieke krachtvelden en de wetten van de klassieke fysica We gingen na tot op welke hoogte het moleculaire mechanica paradigma voldoende accurate thermodynamische resultaten oplevert, en wat de mogelijke kinetische implicaties hiervan zijn. Kwantumchemie tenslotte is de enige theoretische methode die toelaat de geëxciteerde toestanden rechtstreeks te beschrijven. Het is noodgedwongen beperkt tot kleine moleculaire systemen, en moet dus aangewend worden in hybride combinatie met klassieke methoden en elektrostatische modellen. Tot op heden heeft het inzicht in de uitstralende toestand grote progressie gemaakt ten gevolge van deze berekeningen, maar de feitelijke behandeling van de fotofysische verval-processen op het kwantum niveau is nog niet ten volle gestart. Tryptofaanrotameren op een blootgestelde proteïne site: moleculaire dynamica modellering en vergelijking met de X-stralen structuur en fluorescentie-levenstijden. We onderzochten de dynamica van de natieve toestand van de Bacillus caldolyticus cold shock proteïne mutant Bc -Csp L66E, gebruik makende van geschikte moleculaire dynamica methoden. Experimenteel worden twee fluorescentie-levenstijden gevonden, waarvan de amplitudes zeer goed overeenkomen met tryptofaan rotameer populaties, bekomen uit ‘replica exchange’ berekeningen. Rotameer-levenstijden werden voorspeld met behulp van transitietoestandstheorie gebaseerd op simulaties bij hoge temperatuur. Tansitiepaden werden geëxtraheerd uit de transitiesnelheden tussen individuele rotameertoestanden. De moleculaire dynamica maakte ook duidelijk de fluctuaties in de lussen zichtbaar. Tryptofaanrotameren in een geborgen proteïne site: bewijs voor gedeeltelijke ontvouwing in ribonuclease T1 De oorsprong van het biëxponentieel verval van ribonuclease T1 onder licht destabiliserende omstandigheden, zoals verhoogde pH of temperatuur, en de aanwezigheid van detergent, is nog steeds niet gekend. We heben twee lange ‘replica exchange’ moleculaire dynamica simulaties uitgevoerd ten einde een gedetailleerde representatie te bekomen van de natieve toestand in twee protonatietoestanden, representatief voor een hoge en lage pH. Het verschijnen van gedeeltelijk ontvouwde toestanden bij hoge pH werd aangetoond. We vonden dat deze pH-geïnduceerde destabilisatie ontstaat als gevolg van zowel verhoogde globale afstoting als verzwakte gunstige elektrostatische interacties en H-bindingen met His27 en His40. Bij hoge pH verschijnen alternatieve tryptofaan-rotameren en zijn verbonden aan een verstoorde omgeving van tryptofaan, wat ook als een afzonderlijke bron van heterogeniteit in de grondtoestand fungeert. De totale populatie van deze alternatieve rotameren komt goed overeen met de amplitude van de secundaire fluorescentieleeftijd. Hoe wordt cis-trans isomerisatie gecontrolleerd in Dronpa mutanten? Een ‘replica exchange’ moleculaire dynamica studie In het finale hoofdstuk pasten we de verworven MD vaardigheden toe op het bredere probleem van de cis-trans isomerisatie in de chromofoor van een GFP-gerelateerd markeringseiwit. Dronpa, een reversiebel fotoactiveerbare groen fluorescente proteïne analoog, wordt een grote toekomst toegedicht als markeringseiwit voor een verscheidenheid aan nieuwe toepassingen voor visualisatie van cellen en celcomponenten. Gebruikmakend van een ‘replica exchange’ methode die temperatuurs- en Hamiltoniaan-uitwisselingen combineert, werd de dynamica van de elektronische grondtoestand vergeleken tussen Dronpa en twee mutanten die versneld schakelen. De simulatie-data suggereerden dat beide mutaties sterk de flexibiliteit en cis-trans isomerisatie-snelheid van de chromofoor verhogen. We identificeerden drie aminozuren, Val157, Met159 en Phe173, die een sleutelpositie innemen en het ‘bottom hula-twist’ transitiepad kunnen verhinderen, afhankelijk van hun positie en rotameertoestand. We geloven dat onze inzichten zullen helpen het schakelproces te begrijpen en bruikbare informatie zullen verschaffen voor het ontwerpen van nieuwe varianten met verbeterde fluorescentie-eigenschappen. This thesis is devoted to the theoretical study of tryptophan rotamer states in proteins and their possible implications on the fluorescence decay. To this end, we primarily made use of the efficient replica exchange molecular dynamics simulation method and variants thereof. How do rotameric conformations influence the time-resolved fluorescence of tryptophan in proteins? A perspective based on molecular modeling and quantum chemistry We discussed the dynamics of tryptophan rotamers in the context of the nonexponential fluorescence decay in proteins. The central question is: how does the ground-state conformational heterogeneity influence the time evolution of tryptophan fluorescence? This problem was examined here from the theoretical perspective. Three methods at different levels of theory, and with different scopes and computational requirements were reviewed. The Dead-end elimination method is limited to side-chain dynamics and provides an efficient way to detect the stable tryptophan rotamers in a protein. Its application to the study of heterogeneous emission characteristics was illustrated. Molecular dynamics aims at the full phase space of the macromolecule in solution, but must rely on classical force fields and laws of evolution. We examined to what extent the molecular mechanics paradigm yields sufficiently accurate thermodynamic results, and what are the possible kinetic implications. Finally Quantum Chemistry is the only theoretical method that allows a direct assessment of the excited states. It is necessarily restricted to small molecular systems, and thus must be used in a hybrid combination with classical methods and electrostatic models. So far understanding of the emitting state has greatly progressed as a result of these calculations, but the actual treatment of the photophysical decay processes at the quantum level has not yet really started. Tryptophan rotamers at an exposed protein site: molecular dynamics modeling and comparison with X-ray structure and fluorescence lifetimes We investigated the native-state dynamics of the Bacillus caldolyticus cold shock protein mutant Bc -Csp L66E, using appropriate molecular dynamics methods. Experimentally two fluorescence lifetimes are found, the amplitudes of which agree very well with tryptophan rotamer populations, obtained from replica exchange calculations. Rotamer lifetimes were predicted by transition state theory from high-temperature simulations. Transition pathways were extracted from the transition rates between individual rotameric states. The molecular dynamics also revealed the loop fluctuations in the native state. Tryptophan rotamers in a buried protein site: evidence for partial unfolding in ribonuclease T1 The origin of the bi-exponential decay of ribonuclease T1 under mildly destabilizing conditions, such as increased pH or temperature, and the presence of detergent, is still not understood. We have performed two long replica exchange molecular dynamics simulations to obtain a detailed representation of the native state at two protonation states, corresponding to a high and low pH respectively. At high pH, the appearance of partially unfolded states is evident. We found that this pH-induced destabilization originates from increased global repulsion as well as reduced local favorable electrostatic interactions and reduced H-bonding strength of His27 and His40. At high pH, alternative tryptophan rotamers appear and are linked to a distorted environment of the tryptophan, which also acts as a separate source of ground state heterogeneity. The total population of these alternative conformations agrees well with the amplitude of the secondary fluorescence lifetime. How is cis-trans isomerization controlled in Dronpa mutants? A replica exchange molecular dynamics study In the final chapter we applied the acquired MD skills to the broader problem of the cis-trans isomerisation of a GFP-related marker chromophore. The reversibly photoactivatable green fluorescent protein analog Dronpa holds great promise as a marker for various new highly sensitive cellular imaging applications. Using a replica exchange method which combines both Hamiltonian and temperature exchanges, the ground-state dynamics of Dronpa and two mutants with increased switching kinetics, Val157Gly and Met159Thr, were compared. The dominant chromophore state was found to be the cis isomer in all three proteins. The simulation data suggested that both mutations strongly increase the chromophore flexibility and cis-trans isomerization rate. We identify three key amino acids, Val157, Met159 and Phe173, which are able to impede the bottom hula-twist transition path, depending on their position and rotameric state. We believe our insights will help to understand the switching process and provide useful information for the design of new variants with improved fluorescence properties. Conformationele Vrijheid van Chromoforen in Proteïnen met behulp van Moleculaire Modellering Proteïnen zijn macromolekulen die verantwoordelijk zijn voor de werking van een levende cel. Om te begrijpen hoe proteïnen functioneren, is het nodig zich een beeld te vormen van de interne bewegingen die in deze macromolekulen mogelijk zijn. We bestudeerden de dynamische eigenschappen van proteïnen door middel van computersimulaties. Proteïnen bestaan uit een lange hoofdketen met zijketens op regelmatige posities. Deze thesis is gericht op de bewegingen van de zijketens. Bijzondere aandacht ging naar de tryptofaan-zijketen, vanwege haar uitzonderlijke fluorescentie-eigenschappen. De fluorescentie van deze zijgroep is zeer gevoelig aan de vorm van zijn proteïne-omgeving, wat tryptofaan zeer geschikt maakt als sonde voor het volgen van de proteïne-bewegingen. Met onze computersimulaties hebben we het fluorescentiegedrag van kleine model-proteïnen verklaard. Het doel is om deze informatie te kunnen gebruiken voor de studie van andere, nog niet onderzochte proteïnen. Als eerste onderzochten we de cold-shock proteïne. De tryptofaan-zijketen is gelegen aan de oppervlakte van dit globulair eiwit. We ontdekten dat tryptofaan verschillende orientaties kan aannemen, die elk zorgen voor een verschillend fluorescentie-patroon. Ook vonden we dat de orientaties waarbij tryptofaan meer afgeschermd is van het water, stabieler zijn dan de meer aan het water blootgestelde orientaties. Dit resultaat stimuleerde ons om na te gaan of er ook verschillende orientaties kunnen bestaan wanneer de tryptofaan-zijketen binnenin een eiwit zit, volledig afgeschermd van het water. Een goed voorbeeld van een ingesloten tryptofaan wordt aangetroffen in het ribonuclease T1. De simulaties toonden aan dat door de insluiting de beweeglijkheid van de zijketen grotendeels wordt onderdrukt. Evenwel vonden we ook dat in licht basisch milieu een gedeeltelijke ontvouwing van de proteïnestructuur optreedt, waarbij de tryptofaan-omgeving sterk wordt verstoord en meerdere orientaties mogelijk worden. Tenslotte gingen we na of bewegingen ook het fluorescentiegedrag bepalen in dronpa, een sterk fluorescerend molecule dat met behulp van licht aan- en uitgeschakeld kan worden. We zagen dat de fluorescerende groep (de fluorofoor) twee vormen kan aannemen, en dat de overgang tussen deze twee vormen sterk afhankelijk is van de zijketens rond de fluorofoor. Door de simulaties van Dronpa te vergelijken met die van enkele mutanten die nog sneller aan- en uitgeschakeld kunnen worden, waren we in staat het schakelmechanisme beter te begrijpen.