Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Bijdrage tot de bepaling en het begrijpen van de substraatselectiviteit van endoxylanasen Endoxylanasen worden vaak gebruikt in allerhande industriële graanverwerkende processen, zoals de broodbereiding en de gluten zetmeel scheiding, om de procescondities en de kwaliteit van de eindproducten te verbeteren. Hun effecten zijn gebaseerd op de hydrolyse van arabinoxylanen (AX), niet-zetmeelpolysachariden aanwezig in celwandmateriaal van graangewassen. De functionaliteit van endoxylanasen in deze toepassingen is echter vaak niet goed begrepen. Dit is voornamelijk te wijten is aan het feit dat hun substraten aanwezig zijn onder een water-extraheerbare (WE-AX) en een niet-water-extraheerbare vorm (NWE-AX), gekenmerkt door verschillende fysicochemische eigenschappen. Endoxylanasen kunnen enerzijds NWE-AX hydrolyseren (vrijzetting van enzym-gesolubiliseerde AX (ES-AX)). Daarnaast kunnen ze WE-AX en ES-AX degraderen tot fragmenten met lagere molecuulgewichten (MG). In deze context wordt endoxylanase substraatselectiviteit gedefinieerd als de capaciteit van een endoxylanase om NWE-AX te solubiliseren over zijn capaciteit om WE-AX te hydrolyseren. Afhankelijk van de industriële toepassing is een voorkeur van het endoxylanase voor NWE-AX of WE-AX gewenst, terwijl de activiteit ten opzichte van de andere populatie ongewenst is. In een eerste deel van dit doctoraatsonderzoek werd de substraatselectiviteit bepaald van acht endoxylanasen van verschillende oorsprong en behorend tot verschillende glycoside hydrolase families. In uitgebreide en arbeidsintensieve incubatie experimenten werd de substraatselectiviteit bepaald na incubatie van geïsoleerde tarwebloem NWE-AX en WE-AX met verschillende endoxylanase dosissen. Daarnaast werd, gebruik makend van microtiterplaten en gekleurde substraten, een methode ontwikkeld voor de snelle screening van endoxylanasen voor substraatselectiviteit. De bekomen resultaten toonden aan dat endoxylanasen sterk kunnen verschillen in hun substraatselectiviteit en dat deze substraatselectiviteit een grote invloed heeft op het MG van de gesolubiliseerde tarwebloem AX fragmenten. Vervolgens werden verschillende factoren bestudeerd, die verantwoordelijk geacht worden voor de verschillen in substraatselectiviteit tussen endoxylanasen. De substraatspecificiteit van de endoxylanasen, die bepaald wordt door de moleculaire architectuur van de actieve “site” van de enzymen, was de eerste factor die werd bestudeerd. Vooreerst werd de impact van de arabinose over xylose verhouding (A/X verhouding) van het substraat op de substraatselectiviteit van endoxylanasen bestudeerd door wateronoplosbaar en wateroplosbaar haverkaf AX, waarvan de xylan ruggengraat slechts weinig arabinose-substituenten draagt, te incuberen met de verschillende endoxylanasen. De resultaten van deze experimenten duidden op een verschil tussen endoxylanasen in hun capaciteit om om te gaan met geaggregeerde onoplosbare haverkaf AX of verknoopte NWE-AX substraten en suggereerden dat de A/X verhouding waarschijnlijk niet bepalend is voor verschillen in endoxylanase substraatselectiviteit. Vervolgens werden de hydrolyseproducten, gevormd na incubatie van haverkaf AX en verschillende xylo-oligosachariden, geïdentificeerd en gekwantificeerd na verschillende incubatietijden. Grote verschillen in katalytische efficiënties op de xylo-oligosacharide-substraten werden teruggevonden tussen de acht endoxylanasen. Tussen de substraatselectiviteiten enerzijds en de gevormde hydrolyseproducten en de overeenkomstige katalytische efficiënties anderzijds, kon geen relatie gevonden worden. Deze vaststellingen, samen met de resultaten van de incubatie experimenten met haverkaf AX, duidden aan dat de substraatspecificiteit van endoxylanasen waarschijnlijk niet de (enige) bepalende factor is voor de substraatselectiviteit van endoxylanasen. Een tweede factor die verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de verschillen in substraatselectiviteit tussen endoxylanasen is een verschillend partitiegedrag van deze enzymen naar een onoplosbaar substraat in de vaste fase en een oplosbaar substraat in de waterige fase. De productie van endoxylanasen met veranderde substraatselectiviteit door de mutatie van oppervlakte aromatische residu’s toonde het belang aan van deze specifieke residu’s in de substraatselectiviteit van endoxylanasen.