Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Gelatines zijn hydrocolloïden welke verkregen worden via gedeeltelijke afbraak (hydrolyse) van natief collageen. Via een zure of basische voorbehandeling verkrijgt met respectievelijk een basisch of zuur gelati ne. Het oplossingsgedrag in water van deze biopolymeren vertoont relatief we inig gelijkenis met dat van globulaire eiwitten maar gelijkt sterk op da t van een organisch polymeer in een neutraal solvent. In deze studie fra ctionneren we een totaal zuur gelatine (pI = 5) met simpele alcoho l coacervatie om zo aparte alfa fracties (alfa1 en alfa2) te bekom en. De gelatines met hoge moleculaire massa coacerveren (uitz inken) we in een compacte en visceuze onderste fase terwijl kleinere ket ens in de heldere bovenstaande oplossing blijven. Optimaal laat men een 2% (g/v) gelatine sol in 0,8 M NaCl coacerveren met twee volumes ethanol tegenover één volume gelatine sol. Dit levert in de bovensta ande fase (supernatans) alfa2 op waarbij alfa1 grotendeels in het coacer vaat terechtkomt. Een tweede coacervatie onder verschillende exper imentele condities van een eerste coacervaat levert geen afgezonderd alf a1 op en daarom passen we semipreparatieve gelchromatografie (Sephacryl S-400 HR kolom) toe om alfa1 op te zuiveren. In een tweede stap onderzoe ken we alfa1, alfa2, coacervaat en een totaal staal met FTIR spect roscopie. Dit toont minieme verschillen aan in de transitietempera turen (smelten en geleren) op één belangrijk element na: alfa2 gela tinegelen hebben een smeltpunt dat 2 graden Celsius lager ligt dan dat van alfa1. Door 2-dimensionele correlatie analyse uit te voere n tonen we beta-achtige structuren aan bij hogere temperatuur en leggen een link met vouwprocessen tijdens het geleren.Losstaand van deze f ysicochemische karakterisatie van alfa fracties hebben we coacervatie op zichzelf bestudeerd onder een groot aantal verschillende condities.&nbs p; We hebben de coacervatie kinetiek onderzocht met behulp van tur bidimetrie. We varieerden daarvoor pH, gelatineconcentratie, zout concen tratie en volume toegevoegd ethanol. Ook turbiditeitsspectra werden geno men in de tijd om zo de deeltjesgrootte te bepalen. Door alle exper imentele data te analyseren en te combineren met gekende feite n uit de literatuur stellen wij een gedetailleerd coacervatiemodel voor voor simpele alcoholcoacervatie van gelatines.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Hogedrukstudie van amyloïdfibrillen In nagenoeg elk biologisch proces is de tussenkomst van gespecialiseerde eiwitten vereist. Synthese van proteïnen, transport van moleculen doorheen membranen, opslag van energie en katalyse van verschillende reacties: het zijn maar een aantal voorbeelden waarbij de tussenkomst van eiwitten noodzakelijk is. Voor het uitvoeren van deze verschillende taken is een diversiteit in structuur vereist. Eiwitten zijn lineaire biopolymeren die opgebouwd zijn uit aminozuren. Deze aminozuren zijn aan elkaar gelinkt door middel van een peptidebinding. Een verschil in lengte en samenstelling van deze aminozuren bij verschillende proteïnen geeft aanleiding tot andere structuren. Hieruit blijkt dat een correcte vouwing van het eiwit noodzakelijk is om zijn functie naar behoren te kunnen uitoefenen. Een verkeerde vouwing van het eiwit kan leiden tot een eiwit dat niet langer functioneel is of tot een aggregaat (Dobson, 2003). Het neerslaan van deze geaggregeerde eiwitten, de zogenaamde amyloïdfibrillen, is één van de kenmerken van een aantal moleculaire ziektes, zoals bijvoorbeeld de ziekte van Alzheimer en spongiforme encefalopathie bij runderen (BSE). Ondanks het feit dat ze uit verschillende eiwitten gevormd kunnen worden, hebben deze amyloïdfibrillen toch een groot aantal gemeenschappelijke kenmerken, zoals de b-kruisstructuur (Serpell et al., 1997), kleuring met congorood (Westermark et al., 1999), verhoogde fluorescentie van thioflavine T (Le Vine, 1997) en een opmerkelijke resistentie ten opzichte van proteases. De precieze driedimensionale structuur van de amyloïdfibrillen is nog niet opgehelderd. Dit heeft twee redenen: (i) X-stralenkristallografie is niet mogelijk omdat men geen kristallen kan maken van de amyloïdfibrillen en (ii) omwille van de onoplosbaarheid van de fibrillen is het bepalen van de structuur met kernmagnetische resonantie (NMR) in oplossing ook geen optie. Er werden reeds verschillende modellen voorgesteld die proberen de driedimensionale structuur van de amyloïdfibrillen te beschrijven. Eén hiervan is de parallelle b-helix (Wetzel, 2002). Een aantal eiwitten, zoals de pectinases, nemen van nature deze parallelle b-helix als conformatie aan (Jenkins & Pickersgill, 2001). Onze aanpak om meer informatie te vergaren over de interacties die belangrijk zijn tijdens de vorming van de fibrillen en over eventuele caviteiten in de driedimensionele structuur van de amyloïdfibrillen, bestaat uit het gebruik van hoge hydrostatische druk. Dit kan op verschillende manieren: (i) De stabiliteit van de amyloïdfibrillen onder hoge druk kan worden getest. (ii) De invloed van een hogedrukbehandeling op de fibrillogenese kan worden nagaan. (iii) Het proces van amyloïdfibrilvorming kan onder druk gevolgd worden. (iv) De stabiliteit onder hoge druk van pectinemethylesterase (PME), een enzym dat als natieve conformatie de parallelle b-helix aanneemt, kan onderzocht en vergeleken worden met de stabiliteit van amyloïdfibrillen. De twee gebruikte technieken in deze studie zijn Fouriergetransformeerde infraroodspectroscopie (FTIR-spectroscopie) en atomairekrachtmicroscopie (AFM). FTIR-spectroscopie biedt enerzijds de mogelijkheid om de secundaire structuur van eiwitten te achterhalen en met behulp van de diamantaambeeldcel (DAC) kunnen drukgeïnduceerde veranderingen in situ gevolgd worden tot 1,5 GPa. AFM geeft anderzijds informatie over de morfologie van de aggregaten in functie van de tijd of na drukbehandeling. Ook andere eiwitten die niet met een ziektebeeld geassocieerd zijn, zoals bijvoorbeeld insuline, kunnen amyloïdfibrillen vormen. Dit suggereert dat de eigenschap om deze fibrillen te vormen algemeen is. In hoofdstuk 5 werd de fibrilvorming van het wildtype (WT)-insuline onderzocht en vergeleken met dat van twee mutanten, nl. despentapeptide-insuline (DPI) en des-(B1,B2)-insuline. Bij DPI zijn er vijf aminozuren aan het carboxyluiteinde van de B-keten verwijderd, bij des-(B1,B2)-insuline werden twee aminozuren aan de N-terminus van diezelfde keten weggehaald. De fibrilvorming bij WT-insuline, DPI en des-(B1,B2) was gelijkaardig, op enkele kleine verschillen na. De band die karakteristiek is voor de b-vouwbladstructuur heeft een kleine roodverschuiving ondergaan in het IR-spectrum van de mutanten. Ook op het vlak van morfologie kan men opmerken dat er bij de fibrillen van WT-insuline een helicale draaiing terug te vinden is, maar niet bij de fibrillen van de insulinemutanten. Eerder al werd gepoogd een correlatie te vinden tussen de positie van de band die duidt op b-vouwbladstructuur en de verschillende morfologie, maar deze bleek niet te kloppen (Nielsen-Garriques et al., 2002). Drukbehandeling van de WT-insulinefibrillen tot 1 GPa leverde enkel maar kleine veranderingen op in het spectrum. We konden echter geen ontvouwing van de fibrillen waarnemen. De drukstabiliteit van de fibrillen gevormd door de insulinemutanten was gelijkaardig. Om meer inzicht te krijgen in de veranderingen die onder druk gebeuren, werd de waterstof/deuterium (H/D)-uitwisseling gevolgd onder druk. Dit experiment maakte duidelijk dat er zelfs onder hoge druk geen volledige uitwisseling van protonen tegen deuteronen plaatsvond. Hieruit kunnen we besluiten dat de insulinefibrillen op zijn minst een kern moeten hebben die niet toegankelijk is voor het solvent, zelfs niet onder hoge druk. Een mogelijke verklaring voor de kleine veranderingen die werden waargenomen in het IR-spectrum, is dat de protofilamenten waaruit fibrillen bestaan, uit elkaar gaan, waarbij een kern van b-vouwbladstructuur behouden blijft. Al deze veranderingen onder druk waren omkeerbaar, zoals bleek uit het IR-spectrum bij atmosferische druk en de AFM-beelden na drukbehandeling. Deze resultaten zetten er ons toe aan om een ander amyloïdsysteem onder druk te bestuderen. Transthyretine105-115-peptide (TTR105-115), de b-streng G in transthyretine, werd bestudeerd in hoofdstuk 6. Van dit peptide was reeds aangetoond dat men er in vitro vlot fibrillen van kan maken (Gustavsson et al., 1991). De fibrilvorming bij TTR105-115 gaat trager dan bij insuline, wat de mogelijkheid biedt om de drukstabiliteit op verschillende momenten in het proces te onderzoeken. Na één dag is er in het spectrum van TTR105-115 een smalle band bij 1624 cm-1 (b-vouwbladstructuur) op te merken, maar ook nog enkele andere banden, die bijdragen zijn van bochtstructuren en ongeordende structuren. Op de AFM-beelden kunnen we zien dat er in dit stadium zowel fibrillair als amorf materiaal aanwezig is. De hogedrukstudie toonde aan dat deze vroege aggregaten reeds bij een druk van ~200 MPa gedissocieerd kunnen worden. Na een incubatie van vier dagen ligt het maximum van de amide I’-band uitgesproken bij 1624 cm-1. Op dat tijdstip zijn op de AFM-beelden mature amyloïdfibrillen waar te nemen. Het IR-spectrum en de morfologie van TTR105-115 lijken op die van insuline. Hogedrukbehandeling tot 1,2 GPa was niet voldoende om enige verandering in het IR-spectrum van de mature TTR105-115-fibrillen te induceren. Zelfs een combinatie van hoge druk en hoge temperatuur slaagde er niet in om het b-vouwbladgehalte te verminderen. Deze resultaten zijn in strijd met de drukdestabilisatie die gevonden werd voor TTR zelf en a-synucleïne (Foguel et al., 2003). De amyloïdfibrillen van deze eiwitten konden beide gedissocieerd worden bij een druk van ~200-300 MPa. Blijkbaar hebben de fibrillen gevormd door verschillende proteïnen of peptiden niet dezelfde drukstabiliteit. Een verklaring hiervoor zouden we kunnen vinden door te veronderstellen dat de fibrillen onderzocht door Foguel et al. (2003) slechts vroege aggregaten waren en nog geen mature fibrillen. De drukinstabiliteit die gevonden werd voor de vroege aggregaten van TTR105­115 wijst erop dat in het vroege stadium van de fibrilvorming vooral hydrofobe en elektrostatische interacties, die tegengewerkt worden door druk, een belangrijke rol spelen. In een later stadium kunnen we de drukstabiliteit van de mature fibrillen verklaren door het hechte waterstofbruggennetwerk dat gevormd wordt en de afwezigheid van caviteiten. Er werd na de drukbehandeling van de vroege aggregaten van TTR105-115 reeds opgemerkt dat de intensiteit van de band bij 1624 cm-1, die wijst op b-vouwbladstructuur, was gestegen. Dit suggereert dat door de drukbehandeling meer fibrillen gevormd werden. In hoofdstuk 7 bestuderen we de eigenschappen van deze drukgeïnduceerde fibrillen. AFM-beelden genomen voor en na de drukbehandeling toonden inderdaad een verhoogde opbrengst aan fibrillen aan. Deze drukgeïnduceerde fibrillen hadden dezelfde morfologie en IR-spectrum als de fibrillen die gevormd werden bij atmosferische druk. Als we echter naar hun drukstabiliteit kijken, dan zien we dat deze drukgeïnduceerde fibrillen deze stabiliteit nog niet verworven hadden, maar het toepassen van meerdere cycli verhoogde wel hun drukstabiliteit. Deze hogere opbrengst aan fibrillen lijkt erop te wijzen dat drukbehandeling een kleine verandering induceert in de conformatie. Deze gewijzigde conformatie heeft een grotere neiging tot fibrilvorming. Andere verklaringen zijn dat drukbehandeling meer nuclei induceert of dat intermediairen, die niet naar fibrilvorming leiden, gedissocieerd worden door hoge druk. Meer informatie over de drijvende kracht achter de fibrilvorming van TTR105-115 en insuline kan verkregen worden door deze te volgen bij relatief lage druk (~100-120 MPa). Hierbij vonden we dat de fibrillogenese bij TTR105­115 vertraagd werd; de fibrilvorming bij insuline daarentegen werd volledig geïnhibeerd. Voor insuline kan de verklaring voor de volledige inhibitie gezocht worden in het feit dat de combinatie hoge temperatuur (nodig voor fibrilvorming) en druk zorgde voor een volledig ontvouwen conformatie van insuline. Deze conformatie is vermoedelijk te sterk ontvouwen om nog aanleiding te geven tot fibrillen. Anderzijds kan het zijn dat hydrofobe en elektrostatische interacties zo belangrijk zijn bij de eerste stappen van fibrilvorming van insuline, dat het tegenwerken hiervan door de drukverhoging het proces volledig inhibeert. Voor TTR105-115 blijken daarentegen zowel waterstofbrugvorming als hydrofobe interacties een rol te spelen in het vroege stadium van fibrilvorming, gezien het proces enkel vertraagd maar niet geïnhibeerd werd. De belangrijke rol van de waterstoffen in dit stadium werd bevestigd door een moleculairedynamicastudie op dit peptide (Paci et al., 2004). In hoofdstuk 8 werd tenslotte de drukstabiliteit van de mature fibrillen vergeleken met die van PME van Aspergillus aculeatus. Voor dit enzym werd reeds eerder aangetoond dat er geen drukinactivatie bekomen kon worden na behandeling bij 700 MPa (Duvetter et al., 2005). Gezien de natieve conformatie van PME de parallelle b-helix, één van de voorgestelde modellen voor de opbouw van de amyloïdfibrillen, is, zouden deze structuren wel eens gelijkaardig kunnen zijn. Hogedrukbehandeling tot 1 GPa leidde niet tot ontvouwing van de conformatie van PME. Boven 1 GPa namen we wel veranderingen waar in het IR-spectrum die duiden op ontvouwing. Hieruit kunnen we besluiten dat de druk die nodig is om PME te ontvouwen (1 GPa), hoger ligt dan voor de meeste eiwitten en dus van dezelfde grootteorde is als de drukstabiliteit van de mature TTR105-115-fibrillen. De hoge drukstabiliteit van de b-helices kan verklaard worden door het hechte waterstofbruggennetwerk, de afwezigheid van caviteiten en de verticale stapeling van alifatische en aromatische aminozuurresiduen in de b-helix. Terwijl mature fibrillen ook stabiel zijn bij hoge temperaturen, wordt deze eigenschap niet teruggevonden bij PME. De ontvouwings- en ook inactivatietemperatuur voor dit enzym ligt bij ~55°C (Duvetter et al., 2005). Dit wijst erop dat er toch nog een verschil moet zijn tussen natieve parallelle b-helices en amyloïdfibrillen, wat er voor zorgt dat deze laatsten zowel stabiel zijn bij hoge druk als bij hoge temperatuur. Een hogere dehydratatiegraad van de amyloïdfibril is een mogelijke verklaring hiervoor. We kunnen hieruit besluiten dat het gebruik van hoge druk veel mogelijkheden biedt om informatie te verkrijgen over de structuur van amyloïdfibrillen en de verschillende interacties die een rol spelen tijdens de fibrilvorming. Het is zelfs mogelijk om de fibrilvorming van TTR105-115 enerzijds te vertragen onder druk, anderzijds werd een verhoogde opbrengst aan fibrillen verkregen na hogedrukbehandeling. Een snellere en hogere productie van amyloïdfibrillen biedt de mogelijkheid om geneesmiddelen voor amyloïdziekten efficiënter te testen. High pressure as a tool to investigate amyloid fibrils The specialised function of proteins is required in nearly every biological process. The production of other proteins, transport of different molecules through membranes, storage of energy and catalysis of different reactions are only some of the actions in which the involvement of proteins is essential. This diversity in tasks also calls for a variety in structure. Proteins are all linear biopolymers consisting of amino acids connected by peptide bonds, but differ in length and amino-acid composition, giving rise to distinct conformations. Correct folding is thus necessary for proteins to execute their job. Misfolding of proteins can lead to an unfunctional protein and/or aggregation (Dobson, 2003). Deposition of aggregated proteins, the so-called amyloid fibrils, is one of the hallmarks of several molecular diseases, such as Alzheimer’s disease and bovine spongiform encephalopathy (BSE). Amyloid fibrils formed by different proteins share some properties, such as the cross-b structure (Serpell et al., 1997), staining by congo red (Westermark et al., 1999), increase of thioflavin T fluorescence (Le Vine, 1997) and a remarkable stability towards proteases. However, the exact three-dimensional (3D) structure of the amyloid fibrils has not yet been elucidated, because high-resolution techniques such as X-ray crystallography and solution nuclear magnetic resonance (NMR) are impossible due to inability to crystallise the amyloid fibrils and their low solubility, respectively. Different models have been proposed for the 3D structure of the fibrils. One of them is the parallel b-helix (Wetzel, 2002). This conformation is also adopted as a native fold by some proteins, e.g. the pectinases (Jenkins & Pickersgill, 2001). Our approach to gain more information on the interactions important in amyloid fibril assembly and on the possible presence of cavities in the three-dimensional structure of amyloid fibrils was the use of high hydrostatic pressure (HHP). HHP can here be applied in different ways: (i) to test the stability of the amyloid fibrils, (ii) to investigate the influence of a HHP treatment on the process of fibril formation, (iii) to follow fibrillogenesis under pressure and (iv) to probe the pressure stability of pectin methylesterase, a native b-helical protein. The two applied techniques for this study are Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and atomic force microscopy (AFM). FTIR spectroscopy enables us to determine the secondary structures present in the protein and, in combination with the diamond anvil cell (DAC), pressure-induced changes up to 1.5 GPa can be followed in situ. Alternatively, AFM images provide information on the morphology of the aggregated species as a function of time, but also after HHP treatment. Other proteins, not associated with amyloid disease, such as insulin, have also been shown to form fibrils, suggesting that this is a generic property. In chapter 5, we investigated the assembly process of wild-type (WT) insulin fibrils and compared it with two of its mutants, despentapeptide insulin (DPI) and des-(B1,B2)-insulin. DPI lacks five amino acids at the carboxyl terminus of the B-chain, whereas in des-(B1,B2)-insulin two amino acids at the N-terminus in the same chain have been removed. Fibrillogenesis of WT insulin, DPI and des-(B1,B2)-insulin was quite similar, but showed some distinctions as well. A small red shift could be observed when comparing the IR spectrum of WT insulin with the spectra of DPI and des-(B1,B2)-insulin. There was also a small difference in morphology: whereas the diameter and the amount of fibrils of both WT and mutant fibrils were much alike, a helical winding could be seen for WT insulin fibrils, but was not observed in the case of the mutant insulin fibrils. It has been suggested that morphological differences are associated with small shifts of the IR band, indicative for b-sheet structure (Nielsen-Garriques et al., 2002), but the correlation was not found to be general. Pressurisation of the insulin fibrils up to 1 GPa revealed that only small spectral changes took place, but no unfolding. Pressure stability of the insulin mutant fibrils was found to be similar. Hydrogen/deuterium (H/D)-exchange experiments were performed on the insulin fibrils under pressure to gain more insight into the events occurring under pressure. They revealed that, even under HHP, no complete exchange of protons took place. These H/D-exchange results together with the pressure stability indicated that insulin fibrils have a solvent-inaccessible core, even under HHP. A possible explanation for the small spectral changes observed under pressure is the dissociation of the fibril into its protofilaments, thereby maintaining a core of b-structure. All changes under pressure appeared reversible, as had been shown by the recovered IR spectrum at atmospheric pressure and the AFM images made after HHP treatment. The results on the pressure stability of the insulin fibrils urged us to investigate another amyloid system under HHP. Transthyretin 105-115 peptide (TTR105-115), corresponding to b-strand G of the full-length TTR, was under study in chapter 6. This peptide has been shown to readily form amyloid fibrils in vitro (Gustavsson et al., 1991). The fibrillogenesis of TTR105-115 required a longer incubation period than insulin, providing the opportunity to study the stability at different time points. After one day, the spectrum of the TTR105-115 species exhibited a small band at 1624 cm-1, indicative for b-sheet structure, but also some other spectral contributions, such as turns and disordered structures, could

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Volume 75 of Reviews in Mineralogy and Geochemistry addresses a range of questions that were articulated in May 2008 at the First Deep Carbon Cycle Workshop in Washington, DC. At that meeting 110 scientists from a dozen countries set forth the state of knowledge about Earth's carbon. They also debated the key opportunities and top objectives facing the community. Subsequent deep carbon meetings in Bejing, China (2010), Novosibirsk, Russia (2011), and Washington, DC (2012), as well as more than a dozen smaller workshops, expanded and refined the DCO's decadal goals. The 20 chapters that follow elaborate on those opportunities and objectives.

Carbon cycle (Biogeochemistry)