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Le glioblastome est le type de tumeur cérébrale le plus agressif et le plus fréquent. Actuellement, le traitement standard repose sur une résection maximale de la masse tumorale, suivie de radio- et/ou de chimiothérapie. Malgré cela, l’espérance de vie médiane des patients demeure d’à peine plus d’un an. Cette issue fatale s’explique par la résurgence systématique de la tumeur, dont des cellules aux propriétés de cellules souches sont responsables. La résistance de ces dernières aux traitements précités s’explique notamment par des altérations de la voie de signalisation de l’apoptose, conduisant à un destin anti-apoptotique favorisant la prolifération tumorale. Ainsi, de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à cibler et détruire spécifiquement ces cellules sont recherchées. Parmi elles, l’utilisation d’un virus de l’herpès simplex oncolytique (oHSV) armé avec un transgène pro-apoptotique, seul ou combiné avec d’autres activateurs de l’apoptose, s’est montrée prometteuse.
Pendant ce mémoire, un oHSV armé avec la forme soluble de TRAIL (sTRAIL) placée sous le contrôle du promoteur fort CMV a été caractérisé concernant sa capacité à induire la voie ligand- dépendante de l’apoptose dans plusieurs lignées primaires de glioblastome. En parallèle, l’efficacité de l’ABT-737, un BH3-mimétique capable d’induire la voie mitochondriale de l’apoptose, a également été évaluée. Enfin, un traitement combiné avec le oHSV armé et l’ABT-737 a été testé afin de déterminer si la stimulation simultanée des deux voies de l’apoptose entrainerait un effet synergique.
Le virus armé dans lequel sTRAIL est placé sous le contrôle du promoteur CMV permet de sécréter sTRAIL dans le milieu extracellulaire, ainsi que d’activer l’apoptose dans plusieurs lignées de glioblastome. L’efficacité de l’armement s’est montrée variable entre différents types cellulaires, induisant l’apoptose de manière significativement plus importante qu’un oHSV non armé dans la lignée U87 et n’étant que peu avantageux par rapport à celui-ci dans deux lignées primaires (GB138 et T033). Le traitement avec l’ABT-737 a quant à lui entrainé une diminution de la viabilité dans l’ensemble des lignées testées (T013, T018, T033 et GB138), de manière variable également. Bien qu’un impact plus important ait été mis en évidence lorsque ces deux traitements sont combinés, des expériences supplémentaires sont nécessaires afin de confirmer la présence d’un effet synergique.
La sensibilité variable des cellules à l’infection par oHSV, à sTRAIL et à l’ABT-737 mises en évidence dans ce travail témoigne de l’hétérogénéité intra- et intertumorale du glioblastome. La résistance observée face à l’un ou l’autre traitement met en lumière l’intérêt d’un traitement combiné qui doit être optimisé davantage. Glioblastoma is the most common and agressive malignant brain tumor. The current standard-of-care relies on maximal surgical resection of the tumor mass followed by chemotherapy and radiotherapy. Despite these treatments, the median survival remains extremely poor (around 15 months). This poor prognosis can be explained by a systematic tumor recurrence, mainly due to a population of cells with stem cells properties that develop resistance. Alterations of the apoptotic pathway is considered as one of the hallmarks of cancer, leading to an anti-apoptotic profile and an increased cell proliferation in the tumor mass. Thus, new therapeutic strategies are required to counteract treatment resistance. Among them, the use of an oncolytic herpes simplex virus (oHSV) armed with a pro-apototic transgene has proven its efficiency, both alone and in combination with other pro-apoptotic compounds.
During this master thesis, the ability of the infection of glioblastoma cells with a oHSV armed with the soluble form of TRAIL (sTRAIL) to induce the extrinsic apoptotic pathway has been characterized. Beside, the efficiency of the BH3-mimetic ABT-737 has been evaluated to trigger the intrinsic apoptosis. Finally, both the oHSV armed with sTRAIL and the ABT-737 have been used as a treatment to determine whether there could be any synergy when the two apoptotic pathways are simultaneously activated.
The oHSV armed with sTRAIL placed under control of the CMV promotor allows (i) an efficient sTRAIL secretion in glioblastoma infected cells and (ii) the activation of the extrinsic pathway of apoptosis. The efficiency of the arming strategy was shown to vary among glioblastoma cell lines, with an increased level of apoptosis in U87 cell line compared to two primary cell lines (GB138 and T033). The ABT-737 treatment has proven its capacity to decrease cell viability in every tested cell type (T013, T018, T033 and GB138). Even though a stronger viability decrease was observed when both oHSV-sTRAIL and ABT-737 were tested, additional experiments are required to validate any synergistic effect.
The variable sensitivity of the cells to both oHSV infection, sTRAIL and ABT-737 indicate the high intra- and intertumoral heterogeneity of glioblastoma. Resistance against one or some of these agents confirm the necessity of a combined treatment that still needs to be improved.

oHSV --- glioblastoma --- BH3-mimetics --- oncolytic virus --- apoptosis --- oHSV --- glioblastome --- BH3-mimétique --- virus oncolytique --- apoptose --- Sciences du vivant > Biochimie, biophysique & biologie moléculaire --- Sciences de la santé humaine > Oncologie

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In Varicella-zoster virus (VZV) the most expressed protein during infection is ORF9p.
This protein is conserved in all the Alphaherpesvirus and is an essential tegument
protein. ORF9p interacts with IE62 the major VZV transactivator which is also part
of the tegument although the mechanisms leading to its incorporation into the
particle are poorly understood. Considering that both proteins are present in high
quantity in the viral tegument, it is suggested that one of the ORF9p functions is the
recruitment of IE62 in order to be incorporated into the tegument (Cilloniz et al.,
2007). Previous studies done in the laboratory prove that ORF9p plays an important
role during secondary envelopment and viral particle formation. It is suggested that
this main function is regulated by its phosphorylation and the interaction with other
viral proteins (Riva et al., 2013).
The first goal of this work is to determine if the phosphorylation of ORF9p is
important for the interaction with IE62. The second aim is to determine the
responsible site of ORF9p for the interaction with IE62 and glycoprotein gE.
The role of ORF9p phosphorylation in the interaction with IE62 has been analysed
using different ORF9p mutants lacking a phosphorylation by the ORF47 viral kinase.
On one hand, we have demonstrated that the interaction between ORF9p and IE62
does not depend on the ORF9p phosphorylation level. On the other hand, we
observe a co-localisation of both proteins accumulate in subcellular structures that
accumulates in the vicinity of the nucleus and whose nature has still to be
determined. More broadly, using mutants unable to express ORF47p and/or
ORF66p, the two ser/thr kinases encoded by the virus or-phosphatase
treatments, we showed that nor the phosphorylation of ORF9p or IE62 was
important for their interaction.
In a second part, we evaluate the importance of an WW domain present ORF9p
sequence and shown to be important for HSV-1 VP22 (ORF9p homologue)
interaction with VP16 the major transactivator. ORF9p punctual mutants were
created by mutating the two tryptophan and the phenylalanine described to be
important in HSV-1. Interestingly, F181A and W201F mutations present a loss of
infection over time. Therefore, these two amino acids are perhaps important for
the interaction with IE62 and gE.
These observations confirm that nor the phosphorylation of ORF9p and IE62 or the
amino acids F181 and W201 of ORF9p, located in a putative WW domain are not
important for the interaction between these 2 tegument proteins.

VZV, ORF9p, IE62, phosphorylation, secondary envelopment --- Sciences de la santé humaine > Immunologie & maladie infectieuse

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Le glioblastome multiforme est la forme la plus agressive et la plus répandue des tumeurs gliales. La gravité de ce cancer est définie par sa propagation très rapide, son haut taux de récidive, sa capacité de migration vers la zone sous-ventriculaire et le très mauvais pronostic associé. Malgré les thérapies actuelles, les patients atteints de GBM présentent une survie en général de 12 à 15 mois en raison des récidives particulièrement fréquentes. Il est donc primordial de développer de nouvelles méthodes thérapeutiques qui permettront non seulement de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses mais également d’empêcher toute rechute due aux cellules souches tumorales qui peuvent échapper à la résection. Un nouvel espoir dans la lutte contre ce cancer est l’utilisation de virus atténués, dont fait partie oHSV. 
L’objectif de cette étude est de générer un Herpès virus oncolytique ciblé et armé, dont l’injection directe dans la zone tumorale in vivo permettra la reconnaissance spécifique des cellules tumorales et l’induction de leur mort.
Dans ce travail, nous avons généré une cassette pNES_sTRAIL qui permet l’expression d’une forme soluble de la protéine TRAIL sous le contrôle d’un promoteur nestine, un promoteur activé dans les cellules souches du glioblastome. Grâce à l’utilisation de vecteurs lentiviraux, nous avons démontré l’expression de la protéine sTRAIL dans le cytoplasme de cellules transfectées et transduites, indiquant que le promoteur nestine est bien actif dans les cellules issues de glioblastome. Suite à cela, nous avons prouvé que la protéine sTRAIL induit l’apoptose des cellules issues de lignées cancéreuses gliales transduites avec le virus encodant la cassette pNES_sTRAIL et n’a aucun effet dans les cellules dans lesquelles le promoteur nestine est inactif, confirmant l’efficacité de la construction.
Ces différentes observations confirment la spécificité du promoteur et l’efficacité de la protéine de fusion dans l’induction de l’apoptose. Ces résultats prometteurs offrent beaucoup d’espoir pour la construction d’un oHSV oncolytique.

HSV, glioblastome, oHSV, virus oncolytique, apoptose, signalisation, immunologie --- Sciences de la santé humaine > Immunologie & maladie infectieuse

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Le glioblastome multiforme est un astrocytome agressif de haut grade (OMS, grade IV). Les traitements standard actuels consistent en une résection chirurgicale maximale suivie d’une chimio-/radiothérapie, mais sont confrontés à une récurrence systématique des tumeurs. Ces rechutes seraient liées aux GSCs/GICs, capables d’échapper à la résection en migrant hors des tumeurs cérébrales vers la SVZ et de résister à la radiothérapie. En outre, les GSCs CXCR4+ sont responsables, avec des macrophages de type M2 et des CAFs, de la création d’un microenvironnement pro-tumoral particulier entraîné par une stimulation autocrine et paracrine de la voie CXCL12/CXCR4. Ce microenvironnement CXCR4/CXCL12 favorise le renouvellement, la prolifération et la migration des cellules tumorales, ainsi que l’angiogenèse, la radiorésistance et la modulation immunitaire pro-tumorale. Ainsi, les GSCs et la voie CXCL12/CXCR4 sont devenues des cibles de choix pour de nouvelles thérapies contre la récurrence du GBM et le développement du microenvironnement pro-tumoral. Il a donc été envisagé d’injecter dans la tumeur, un oHSV-1 exprimant des inhibiteurs spécifiques de la voie CXCL12/CXCR4 (oHSV-P2G). Par l’infection et la production continue d’inhibiteurs, oHSV-P2G pourrait causer la lyse des GSC, déclencher une inflammation contre les antigènes viraux et tumoraux, perturber le microenvironnement pro-tumoral, et stimuler la réponse immunitaire. Plus précisément, l’objectif de ce mémoire est de développer oHSV-P2G (dérivé de oHSV ∆ICP34.5 ∆ICP6 ∆ICP47) et de caractériser son effet sur la migration des GSCs médiée par la voie CXCR4/CXCL12. Ceci découlant de résultats indiquant une réduction du nombre de GSCs suite à l’inhibition de cette voie de signalisation.

Sciences du vivant > Microbiologie