Abstract | Keywords | Export | Availability | Bookmark

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Cystische fibrose (CF), ook wel mucoviscidose genoemd, is een zeldzame, progressieve erfelijke ziekte die veroorzaakt wordt door een fout in het ‘cystic fibrosis transmembrane conductance regulator’ (CFTR) gen. Het CFTR proteïne is een essentieel chloride kanaal aanwezig in het apicale membraan van epitheelcellen in meerdere organen waaronder de luchtwegen, het spijsverteringsstelsel en het voortplantingsstelsel. Mutaties in het CFTR gen die leiden tot een niet functioneel proteïne, of zelfs de afwezigheid van het proteïne, resulteren in ernstige symptomen in deze weefsels. Momenteel zijn er geneesmiddelen op de markt die het mutante eiwit beter helpen in zijn werking. Deze zijn beschikbaar voor 90% van de CF patiëntenpopulatie. Voor de resterende 10% CF patiënten is er echter nog geen CFTR-specifieke behandeling beschikbaar. Deze subpopulatie van patiënten hebben voornamelijk zeldzame en vaak ernstige CFTR mutaties. In deze thesis werden twee recent ontwikkelde gen modificatie strategieën onderzocht, om een CFTR mutatie te corrigeren die niet reageert op huidige medicatie. Als eerste werd er gebruik gemaakt van de genmodificatie technologie Base Editing. Base editors zijn in staat om één welbepaalde base in een specifieke DNA regio te wijzigen. Base editors maken hiervoor gebruik van een Streptococcus pyogenes Cas9 proteïne (SpCas9) dat gefuseerd is aan een nucleotide deaminase domein. Een guide RNA (sgRNA) wordt ontworpen die de Base Editor naar de specifieke DNA regio gidst. Het SpCas9 proteïne knipt vervolgens één van de twee strengen van het DNA open. De DNA-bases in deze enkelstrengige DNA sequentie worden blootgesteld aan het nucleotide deaminase en kunnen zo gewijzigd worden. De CFTR mutatie die ik onderzocht, is een puntmutatie die een cytosine base (C) omzet in een guanine base (G). In dit onderzoek heb ik gebruik gemaakt van de meest nieuwe klasse van Base Editors, namelijk de ‘C-naar-G base editor’ (CGBE) om de CFTR mutatie te corrigeren. Een sgRNA molecule werd ontwikkeld om de CGBE naar de genomische sequentie te gidsen. De Base Editor machinerie en de sgRNA werden binnengebracht in HEK293T cellen (Human Embryonic Kidney 293 cells) met behulp van transfectie. Helaas heb ik met deze genmodificatie technologie, geen correctie van de mutatie kunnen waarnemen. Als alternatieve genmodificatie technologie, heb ik het gebruik van Prime Editing (PE) onderzocht om de CFTR-mutatie te corrigeren. PE is een techniek die rechtstreeks nieuwe genetische informatie kan schrijven in een specifieke DNA sequentie. Het PE-systeem werd in dit onderzoek geoptimaliseerd om dezelfde C>G mutatie te corrigeren. Het PE-systeem heeft ook een guide RNA (pegRNA) molecule nodig om het naar de juiste DNA locatie te gidsen. De PE-machinerie tezamen met de pegRNA , werd binnengebracht in HEK293T cellen met behulp van transfectie. DNA analyse heeft aangetoond dat de gebruikte PE-strategie resulteerde in significante correctie van de CFTR mutatie in HEK293T cellen. Als laatste werd onderzocht of deze gen-correctie zich ook vertaalde in de productie van een functioneel CFTR proteïne. Met behulp van Western Blotting heb ik de aanwezigheid van het CFTR proteïne kunnen detecteren en met behulp van een halide sensitieve (HS)-YFP quenching techniek hebben we CFTR-kanaal functionaliteit kunnen bevestigen. In dit onderzoek heb ik kunnen aantonen dat het PE-systeem het fenotype van de onderzochte CFTR mutatie in HEK293T cellen kon herstellen.