Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

MAGE-A1 a été découvert parce qu’il produit un antigène tumoral reconnu par des lymphocytes T cytolytiques. Ce gène appartient à une vaste famille de gènes qui codent des protéines dans un domaine de 170 acides aminés est conservé dans différentes espèces. Le rôle physiologique de MAGE-A1 est encore inconnu. Cependant, des expériences récentes de notre laboratoire ont montré que cette protéine est capable de se lier au co-activateur transcriptionnel SKIP, d’inhiber la transactivation assurée par la portion intracellulaire de Notch et de fixer l’histone déacétylase, HDAC1. Ces résultats suggèrent qu’un rôle possible de MAGE-A1 est de réguler la transcription.
De manière à poursuivre ces observations pour déterminer le rôle physiologique de MAGE-A1 dans deux systèmes de cellules de mammifères en culture, les myoblastes de souris C2C12 et les cellules de rein embryonnaire humain 293.
En exprimant MAGE-A1 dans les cellules C2C12 produisant la partie intracellulaire de NOTCH2 (Notch2-IC), nous voulons étudier l’effet de MAGE-A1 sur un processus de différenciation régulé par NOTCH. Les cellules C2C12 ont la capacité de se différencier en myotubes lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu pauvre en agents mitogènes. Ce processus de différenciation est bloqué par Notch2-IC parce qu’il active les gènes HES et HERP qui produisent des répresseurs inhibant les facteurs de différenciation. Nos résultats montrent que la présence de la protéine MAGE-A1 n’empêche pas les cellules C2C12 de se différencier si ces cellules ne produisent pas Notch2-IC. Cependant, contrairement à nos prévisions basées sur l’observation que MAGE-A1 est capable de contrecarrer la transactivation de Notch1-IC, nous avons observés que MAGE-A1 était incapable de rétablir un processus de différenciation dans des cellules C2C12 bloquées par Notch2-IC. En accord avec ces résultats, des expériences de PCR quantitative ont montré que le nombre de transcrits HES-1 et HERP-2 ne variaient pas dans ces cellules lorsque MAGE-A1 était exprimé.
Dans la deuxième partie de ce travail, nous avions tenté d’utiliser des systèmes commerciaux permettant d’induire l’expression de MAGE-A1 à l’aide de tétracyline dans les cellules de rein embryonnaire humain 293. Nous avons facilement obtenu des clones dans lesquels on pouvait induire la production de grandes quantités de transcrits MAGE-A1. Cependant, nous avons observé qu’en absence d’induction, le niveau d’expression était au moins aussi élevé que celui des cellules de mélanome humain cultivées en laboratoire. Or, nous voulions réprimer totalement l’expression de MAGE-A1 en absence d’induction de manière à éviter des phénomènes de toxicité de la protéine MAGE-A1 observés au laboratoire lorsque cette protéine est présente en grandes quantités dans des cellules humaines en culture. Nous avons dés lors construit deux nouveaux vecteurs recombinants : l’un utilise un vecteur commercial dans lequel on a modifié l’élément de réponse à la tétracycline ; l’autre est un vecteur dans lequel nous avons remplacé le promoteur minimal du virus CMV par un promoteur minimal MAGE-A1. Lorsque nous aurons mis au point des systèmes d’expression inductible de MAGE-A1 présentant un niveau d’expression négligeable en absence d’induction, nous utiliserons ces systèmes et la technologie des microdamiers (microarrays) pour identifier des gènes régulés par MAGE-A1 MAGE-A1 was discovered because it encodes a tumor antigen recognized by cytolytic T lymphocytes. It belongs to a large family of genes encoding proteins with an intra- and interspecies 170 amino acids conserved homology domain. The molecular function of this protein in thus far interacts with transcriptional adaptor protein SKIP, to counteract transactivation by the intracellular part of Notch1 and to bind to histone déacétylase 1. These data suggest that MAGE-A1 has a role in transcriptional regulation.
In order to examine the functional relevance of these observations, we expressed MAGE-A1 in two in vitro systems of mammalian cells, mouse C2C12 myoblasts and human embryonal kidney 293 cells.
Stable expression of MAGE-A1 in parental C2C12 cells and in C2C12 cells expressing the intracellular part of Notch2 (Notch2*-IC) allowed us to study the effect of MAGE-A1 on a differentiation process regulated by Notch. This model relies on the ability of C2C12 myoblasts to differentiate in myotubes when cultures in mitogen-poor medium. This process is blocked by Notch2-IC because it activates the expression of HES and HERP repressors that inhibit the required differentiation factors. According to our results, ectopic expression of MAGE-A1 in C2C12 myoblasts did not affect their capacity to differentiate. However, contrary to our expectations based on the inhibitory effect of MAGE-A1 on Notch1-IC transactivation, MAGE-A1 expression was not able to resume the differentiation process in Notch2-IC-expressing cells. This was confirmed by real-time PCR experiments showing that the amount of HES-1 and HERP-2 transcripts in C2C12 cells was not affected by MAGE-A1 expression.
In the second part of the study, we developed known tetracycline-regulated systems to express MAGE-A1 in human embryonic kidney cells. Induction by the antibiotic could be easily obtained in some selected clones. However, in the absence of induction, these inducible systems yielded a relatively high background level of expression, similar to that measured in melanoma cells cultured in our laboratory. This basal expression level should be tightly controlled in order to avoid toxic effects frequently observed in mammalian cells over expressing MAGE-A1. We therefore constructed two new MAGE-A1 expressing vectors: one is based on a commercial vector with a modified tetracycline response element; the other is a vector containing a MAGE-A1 minimal promoter instead of the current CMV minimal vector. When tightly controlled inducible systems will be available, we will use the microarray technology to identify genes that are regulated by MAGE-A1

Melanoma --- Antigens --- Kidney --- Myoblasts --- Tetracycline

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

T cells directed against tumor-associated antigens can be detected in several types of cancers, including melanoma. Cytotoxic T lymphocytes recognize antigens at the surface of tumor cells and therefore can induce the lysis of those cells. The genes coding for some of these antigens have been identified : they are differentiation genes and are expressed also in normal melanocytes. They encode the tyrosinase, the tyrosinase related proteins 1 and 2, Melan-A/MART1 or gp100/PMEL17.
However, some tumor cells reduce the expression of these antigens and then evade the anti-tumoral immunity. In melanoma cells cultivated in the presence of IL-1, several experiments have shown a decrease in the expression of these differentiation genes and of the transcription factor MITF-M (Microphtalmia-associated transcription factor), which regulates them. It can be suggested that this cytokine, present in the tumoral environment, may be responsible for the decrease in the expression of differentiation antigens and, therefore, favour the escape of tumor cells from the immune system. But, the mechanism used by IL-1 to induce this repression is still unknown. The aim of this work was to study this mechanism.
The first step was to test whether IL-1 acts on the MITF-M promoter or on the mRNA stability. We performed plasmid constructions with the MITF-M promoter (15 kb or 4,5 kb) upstream the luciferase gene and we measured the luciferase activity in the presence or not of IL-1. These experiments do seem not to implicate the promoter in the repression induced by this cytokine.
Then we have tried to evaluate whether there was an instability of the MITF-M mRNA and we expressed plasmid constructs in different tumor cell types (melanomas LB 2259 and LAGI and neuroblastoma SKNBE2) to determine the exact region of the mRNA that can be a target for the signal induced by IL-1. We perfomed constructs with the complete cDNA of MITF or only with the 3’UTR because this region is particulary long (3 kb) and can be responsible for transcript instability. However, although we could not identify the exact region implicated in this regulation, we concluded from our data that the 3’UTR alone was not capable to destabilize the transcript in the presence of IL-1ß.
LB 2259 melanoma cells were also incubated with transcription inhibitors and IL-1 to study MITF-M mRNA decay. These experiments allowed us to conclude that IL-1 does not directly influence MITF-M mRNA stability but promotes the transcription of factors responsible for the decrease in MITF mRNA levels Il a été mis en évidence dans certains types de cancer, dont les mélanomes, qu’il pouvait exister une réponse immunitaire anti-tumorale. Cette réponse est principalement médiée par des lymphocytes T cytolytiques (CTL) capables de reconnaître des antigènes à la surface des cellules de mélanome et d’induire la lyse de ces cellules. Les gènes codant certains de ces antigènes ont été identifiés : il s’agit de gènes exprimés également dans les mélanocytes normaux et qui sont impliqués dans la différenciation des mélanocytes. Ils codent la tyrosinase, les « tyrosinase related proteins », Melan-A/MART1 ou gp100/PMEL17.
Cependant, certaines cellules tumorales vont pouvoir échapper à la réponse immunitaire en réprimant l’expression de ces antigènes de différenciation. Des expériences préalables ont permis d’observer une diminution de l’expression de ces antigènes de différenciation ainsi que d’un facteur de transcription qui les régule, MITF-M (Microphtalmia-associated transcription factor), dans des mélanomes cultivés en présence d’IL-1. Ceci pourrait suggérer que cette cytokine, présente dans l’environnement de la tumeur, serait responsable de la diminution d’expression des antigènes de différenciation et donc de l’échappement à la réponse immunitaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’IL-1ß induit cette répression est encore mal connu. Le projet de ce mémoire est d’étudier ce mécanisme.
Une première étape était de savoir si l’IL-1 agit au niveau du promoteur du gène ou au niveau de la stabilité de l’ARNm. Nous avons donc réalisé des constructions contenant le promoteur du gène MITF-M (15 kb ou 4,5 kb) en amont du gène de la luciférase et mesuré l’activité luciférase en présence ou non d’IL-1. Ces expériences ne semblent pas indiquer que le promoteur soit impliqué dans la répression induite par cette cytokine.
Ensuite, pour mettre en évidence une instabilité du transcrit MITF, nous avons réalisé différentes constructions dans plusieurs lignées cellulaires (mélanomes LB 2259 et LAGI et neuroblastome SKNBE2) afin de déterminer la région exacte du transcrit ciblée par l’IL-1ß. Nous avons réalisé des constructions contenant l’ADNc complet de MITF ou uniquement la région 3’UTR étant donné que celle-ci est particulièrement longue (3 kb) et pourrait donc réguler la stabilité du transcrit. Cependant, nous n’avons pas encore pu identifier la région précise impliquée dans cette régulation, la région 3’UTR seule n’étant pas capable d’induire une déstabilisation en présence d’IL-1.
De plus, la lignée de mélanome LB2259 a été cultivée en présence d’inhibiteurs de transcription et d’IL-1, afin d’étudier la vitesse de dégradation de l’ARNm de MITF-M dans différentes conditions. Ceci a permis de conclure que l’IL-1 n’influence pas directement la stabilité de l’ARNm de MITF-M mais favoriserait la transcription d’intermédiaires responsables de la diminution des taux d’ARNm

Microphthalmia-Associated Transcription Factor --- T-Lymphocytes, Cytotoxic --- Interleukin-1beta --- RNA, Messenger --- Melanoma