Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Chapter 1: Flaviviruses are the cause of countless deaths by haemorrhagic fever or encephalitis in regions with subtropical climates. This virus genus contains over 70 different species of which yellow fever, dengue fever, Zika virus and the Japanese encephalitis virus are some specific examples with a large clinical impact on society. Most flaviviruses are arbovirusses, transferred by arthropods, mainly from the Aedes and Culex genera. The flaviviral E protein is an envelope protein, important for attachment and spread of the virus. It is an important target for neutralising antibodies. Vaccinations are available for yellow fever, dengue fever and Japanese encephalitis. In addition development of a vaccine for the Zika virus is a priority for the near future. Next to vaccination viral assays are essential for diagnostic purposes and viral research. Plaque reduction neutralization test (PRNT) remains the golden standard but it is very time consuming and labour intensive. Therefore, other techniques have been developed and research for new innovation is continuously ongoing. An efficient ELISA is such a method that can be used as a valid alternative next to a PRNT Chapter 2: The aim of this project was to establish an efficient home-made ELISA to characterise and quantify the specific humoral immune responses against flaviviruses. Chapter 3: Expression constructs for the biotinylated monomeric envelope E protein were constructed and cloned for different flaviviruses. Then, the proteins were expressed in HEK293T (human embryo kidney 293T) cells. These proteins were used as an antigen on avidin pre-coated plates for characterisation of antisera. A primary screening on four monoclonal antibodies was performed as a proof of concept for assay performance. Afterwards, antisera of experimentally vaccinated animals were tested for their affinity to the monomeric E proteins. Cytopathic effect neutralization test (CPE-NT), a variant of PRNT, was applied to establish a correlation between the antibody titers and the respective neutralizing efficiency. Additionally, immune fluorescence assays (IFA) were performed for comparison. Chapter 4: The construction of the DNA constructs was successfully accomplished and the HEK293T cells proven to be very good expression vectors for our purposes. Two monoclonal antibodies showed promising results for further experiments ELISA. The ELISA revealed significant reactivity with all sera, including negative controls: no selectivity was proven. The CPE-NT gave inconsistent results and also the IFA performances did not correlate at all with the anticipated assumptions.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Het doel van deze studie was het bestuderen van de opname-kinetiek van specifieke galzouten in verschillende in vitro modellen, dit met als doel te dienen als gegevensbron voor kinetische modelling. Hiervoor werden drie verschillende in vitro modellen gebruikt, namelijk gesuspendeerde rat hepatocyten, OATP1B1- en OATP1B3-getransfecteerde CHO cellijnen en sandwich-culturen van rat hepatocyten (SCRH). De opname van verschillende concentraties chenodeoxycholzuur (CDCA) werd bepaald in alle modellen terwijl de opname van de glycine- en taurine-conjugaten, respectievelijk GCDCA en TCDCA, bepaald werd in gesuspendeerde rat hepatocyten. Analyse van de stalen werd uitgevoerd door middel van HPLC-MS/MS. De staalvoorbereiding moest geoptimaliseerd worden aangezien proteïnen aanwezig in de stalen verantwoordelijk waren voor drukverhoging over de LC-kolom. Deze geoptimaliseerde staalvoorbereiding werd vervolgens gevalideerd voor CDCA en GCDCA. Hierbij werden gegevens verzameld over het effect van staalmatrix samenstelling en werd de intra- en interday variabiliteit bepaald. Voor de opname-experimenten werden acht verschillende concentraties van het galzout (0.5 en 100 μM) geïncubeerd gedurende 1 min in elk van de drie in vitro modellen. Er werd vastgesteld dat de opname van de drie galzouten in gesuspendeerde rat hepatocyten verzadigbaar was. TCDCA werd opgenomen met de hoogste affiniteit, gevolgd door GCDCA en CDCA. De respectievelijke Km waarden waren 14, 46 en 109 μM. Daarnaast werd ook de invloed van pH en proteïnen op de opname van zowel CDCA als GCDCA nagegaan in gesuspendeerde rat hepatocyten. De eerste hypothese was dat opname zou toenemen bij lagere extracellulaire pH. Desondanks werd geen significant effect waargenomen. De tweede hypothese was dat er minder opname ging zijn indien er proteïnen aanwezig waren in het medium aangezien galzouten een hoge proteïnebinding kennen. Galzouten zijn hoofdzakelijk aan albumine gebonden in de systemische circulatie, maar vertonen ook affiniteit voor lipoproteïnen. Het toevoegen van 10 % FBS resulteerde in een verlaagde opname van GCDCA, geassocieerd met toegenomen Km waarde. De opname van CDCA daarentegen, vertoonde een exponentiële toename in tegenstelling tot een gesatureerde opname zonder FBS. Het toevoegen van toenemende concentraties FBS resulteerde in een verdere daling van opname van zowel CDCA als GCDCA maar werd pas significant na toevoegen van 50 % FBS. De opname van CDCA in OATP1B1- en OATP1B3-getransfecteerde cellijnen was lineair met respectievelijke opname klaring van 73 en 89 μL/(mg protein*min). Aangezien de opname door de wild-type (WT) bijna even groot was als de opname door de getransfecteerde cellijnen, werd hiervoor niet gecorrigeerd en zijn de gerapporteerde waarden een weerspiegeling van de totale opname (actief + passief). Ook de opname van CDCA in SCRH werd lineair bevonden met een opname klaring van respectievelijk 20 en 14 μL/(miljoen cellen*min) op dag-1 en dag-3 na zaaien. Door de hoge collageen-binding was de beschikbaarheid van CDCA lager en konden de transporters niet verzadigd worden. Hier moet rekening mee gehouden worden in verdere experimenten met SCRH.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Rotavirus en norovirus zijn wereldwijd de twee meest voorkomende oorzaken van ernstige diarree bij kinderen. Jaarlijks zijn rota- en norovirus-infecties verantwoordelijk voor ongeveer 800 000 sterftegevallen bij kinderen jonger dan vijf jaar. Het op de markt brengen van twee rotavirus vaccins deed de mortaliteit dalen, maar deze vaccins zijn echter nog niet overal in gebruik en niet effectief tegen alle verschillende genotypes. Zowel voor rota- als norovirus-infecties zijn er nog geen antivirale middelen beschikbaar, de huidige behandeling bestaat enkel uit rehydratie door middel van oplossingen met glucose of sucrose en elektrolyten. Het hoofddoel van deze thesis is om virus-specifieke moleculen te vinden die antivirale activiteit vertonen tegen zowel rota- als norovirus-infecties. Om krachtige en selectieve inhibitoren van rotavirus replicatie te identificeren en te evalueren werden antivirale assays uitgevoerd met ST3 en SA11 stammen, rotavirussen afkomstig van respectievelijk mensen en apen. Het antivirale effect van de moleculen werd verder bevestigd en gekarakteriseerd door middel van virusopbrengst-reductie-assays en immunofluorescentie analyses. In parallel werd ook de potentiële toxiciteit van de moleculen voor de cellen bepaald. Om het activiteitsspectrum van de moleculen te bestuderen werden verschillende rotavirusstammen geselecteerd, zodat er geverifieerd kon worden of de moleculen antivirale activiteit vertonen tegen alle klinisch relevante stammen. Deze studie resulteerde in de identificatie van een krachtige en selectieve klasse van inhibitoren die ook antivirale activiteit vertonen tegen norovirus-infecties. Deze zullen verder onderzocht worden, onder meer via mechanistische en in vivo studies. Het gebruik van de ‘High Content Imaging’ techniek (welke momenteel toegepast wordt in de onderzoeksgroep) is veelbelovend om het werkingsmechanisme van deze en toekomstige moleculen op te helderen. Tot op heden is er geen robuust in vitro model beschikbaar om het humaan norovirus te bestuderen. Een recente studie heeft aangetoond dat humaan norovirus B cellen kan infecteren. Enkele pogingen om dit in vitro model in het laboratorium op te zetten waren nog niet succesvol. Aangezien het ontwikkelen van een reproduceerbaar in vitro model heel belangrijk is voor het ontdekken en ontwikkelen van nieuwe antivirale middelen tegen norovirus-infecties, is verder onderzoek zeker vereist.