Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

In december 2004 werd door het UNAIDS het aantal mensen, geïnfecteerd door het humaan immuundeficiëntievirus (HIV), geschat op meer dan 40 miljoen. Ondanks de mogelijkheid om de levensverwachting van HIV-geïnfecteerden te verlengen dankzij de huidige combinatietherapie, is het vandaag nog steeds onmogelijk om het virus volledig uit te roeien. Bovendien is het verschijnen van meervoudig resistente virussen in patiënten, die behandeld worden met de huidige geneesmiddelen, een duidelijk teken dat doorgedreven onderzoek naar antivirale therapie tegen HIV-1 infectie een blijvende noodzaak is. Hierbij is het van belang om alternatieve stappen van de virale replicatiecyclus te inhiberen om zodoende de kans op multiresistentie te verkleinen. Wereldwijd worden inspanningen geleverd om efficiëntere en goedkopere geneesmiddelen te ontwikkelen, zodat deze medicatie voor iedereen toegankelijk wordt, ook voor de mensen in de ontwikkelingslanden, waar de nood het hoogst is. De huidige antiretrovirale middelen richten zich tegen de fusie van het virus met het celmembraan, de reverse transcriptie en de proteolytische klieving van de polyproteïnen tijdens de maturatie van het virus. Tijdens de levenscyclus van HIV-1 is de integratie van het virus in het humaan genoom een cruciale stap voor een productieve infectie en wordt daarom beschouwd als een point of no return. Bijgevolg is integratie een aantrekkelijk nieuw doelwit voor anti-HIV therapie. Bij de aanvangvan mijn doctoraatswerk in 2000, had meer dan 10 jaar onderzoek naar mogelijke integrase (IN) inhibitoren geleid tot de identificatie van slechts 1 klasse authentieke IN inhibitoren, namelijk de diketozuren (Hazuda et al, 2000). Op dat zelfde momentechter was er ook een lead compound, V-165, van een potentiële tweede klasse IN inhibitoren, de pyranodipyrimidines (Pannecouque et al, 2002), aanwezig in ons laboratorium, in een vroeg stadium van preklinische ontwikkeling. Naast de grootschalige evaluatie van mogelijke IN inhibitoren is het essentieel zo veel mogelijk relevante informatie te vergaren omtrent het complex mechanisme van het integratieproces, waarin zowel virale als cellulaire eiwitten een rol spelen. Een goede kennis van het integratiemechanisme is belangrijk voor een doelgerichte ontwikkeling van nieuwe inhibitoren. Hoewel het merendeel van de potentiële integrase inhibitoren geïdentificeerd wordt in in vitro testen en verder geëvalueerd wordt met behulp van onrechtstreekse cellulaire technieken, was het, bij de start van deze thesis, duidelijk dat het integrase onderzoeksdomein nood had aan een test die op een ondubbelzinnige manier het integratieproces rechtstreeks in celcultuur kon meten. Tijdens dit doctoraatsproject werd de real-time kwantitatieve PCR (Q-PCR) technologie geïntroduceerd in het laboratorium. De optimalisatie van drie specifieke Q-PCRs, deels gebaseerd op het artikel van Butler et al. (2001) dattijdens het eerste jaar van dit doctoraat werd gepubliceerd, liet ons toe de drie voornaamste virale DNA vormen te onderscheiden tijdens de HIV-1 levenscyclus: totaal viraal DNA , 2-LTR cirkels en geïntegreerd viraal DNA. Bijgevolg was het mogelijk de kinetiek van de virale replicatiecyclus te volgen, aangezien de 3 virale DNA vormen elk gekoppeld kunnen worden aan de voltooiing van een vroege stap tijdens de HIV-1 replicatie: reverse transcriptie , nucleaire import en integratie. Hierbij was voornamelijk de real-time kwantificatie van de HIV-1 integranten een belangrijke doorbraak in het onderzoek naar inhibitoren van de integratiestap, omdat het nu mogelijk werd om op een ondubbelzinnige manier de in vitrogeïdentificeerde kandidaat IN inhibitoren in celcultuur te valideren. Deze real-time Q-PCR methodologie werd toegepast in de volgende onderzoeksprojecten in ons laboratorium. In de vectorologie werden de ontwikkelde Q-PCRs gebruiktom de impact te bestuderen van de aanwezigheid van de centrale polypurine tract (cPPT) in lentivirale vectoren op de kinetiek van de transductie. Lentivirale vectoren (LV) zijn beloftevolle vehikels voor gentherapie die afgeleid zijn van HIV-1. Het invoegen van de cPPT in het genoom van LV verhoogt drastisch de transductie-efficiëntie, hetgeen te wijten zou zijn aan een verbeterde nucleaire import van het viraal DNA via een centrale DNA flap (Zennou et al, 2000; Follenzi et al, 2000). Via de real-time Q-PCR volgden wij de kinetiek van het totaal viraal DNA, de 2-LTR cirkels en het geïntegreerd proviraal DNA tijdens de lentivirale vectortransductie. Ongeveer 6 tot 12 uur na transductie bereikte het totaal HIV-1 DNA een maximum hoeveelheid, waarna een snelle daling werd vastgesteld. De 2-LTR cirkels stegen in aantal tot zowat 24-48 uur na transductie en gingen daarna verloren door verdere celdeling. Integratie van HIV-1 DNA werd pas gedetecteerd na 12 uur. Wanneer HIV-1 vectoren werden gebruikt die de cPPT bevatten, werd geen significant verschil waargenomen in de virale DNA synthese, maar wel een 3-voudige verhoging in het aantal 2-LTR cirkels. Deze verhoging in 2-LTR cirkels bevestigt de impact van de cPPT op de nucleaire import van het viraal DNA. Bovendien werd ook 10 maal meer geïntegreerd HIV-1 DNA geobserveerd in aanwezigheid van de cPPT. Wanneer de cPPT niet aanwezig was in het vectorgenoom bleek daarenboven de productie van 2-LTR cirkels bij hoge multipliciteit van infectie een verzadigingsniveau te bereiken. Dit suggereert een rol voor de cPPT in het overbruggen van een drempel tijdens de nucleaire import van het HIV-1 DNA. Een mogelijk effect van de centrale DNA flap op de correcte positionering van beide LTRs in het preïntegratiecomplex is weinig waarschijnlijk, gezien transductie met LV die ectopische cPPT fragmenten bevatten, ook resulteerde in een verhoogde hoeveelheid 2-LTR cirkels en HIV-1 integranten. De introductie van de cPPT in het lentiviraal vectorgenoom is ongetwijfeld een verbetering in het onderzoeksdomein van de lentivirale gentherapie. Verdere optimalisatie van de lentivirale vectoren is een absolute vereiste vooraleer deze vectoren hun intrede kunnen doen in dekliniek op een veilige manier. Daarbij kan de Q-PCR methodologie een uitstekend hulpmiddel zijn bij het evalueren van de optimalisatie. Om aan te tonen dat de Q-PCR methode inderdaad kan gebruikt worden om het precieze doelwit van kandidaat IN inhibitoren in celcultuur te bepalen, testten wij de lead moleculen van de beide klassen IN inhibitoren, zijnde het diketozuur, L-708,906 (Hazuda et al, 2000) en het pyranodipyrimidine, V-165 (Pannecouque et al, 2002). De inhibitie van integratie werd geëvalueerd gedurende single-round lentivirale vectortransductie en in parallel, werden ook reverse transcriptase (RT) inhibitoren getest. In aanwezigheid van de RT inhibitoren, azidothymidine (AZT) en α-APA, een non-nucleoside RTinhibitor, was de virale DNA synthese duidelijk geïnhibeerd, terwijl de beide integrase inhibitoren specifiek de integratiestap blokkeerden. Deze Q-PCR analyse leverde dus een bijkomend bewijs dat V-165, de lead molecule van de PDPs, inderdaad de integratie van het virus afremt in celcultuur. Daarom werd vervolgens een grootschalige in vitro evaluatie uitgevoerd van een reeks nieuw gesynthetiseerde PDP derivaten, wat resulteerde in de identificatie van een efficiëntere IN inhibitor, gecodeerd als WD11. Een meer gedetailleerde analyse van deze molecule zowel in vitro als in celcultuur is momenteel lopende in het laboratorium om het exacte werkingsmechanisme te achterhalen en na te gaan of deze molecule als klinische drugkandidaat kan worden ontwikkeld. De huidige in vitro evaluatie van mogelijke IN inhibitoren is vrij artificieel gezien de afwezigheid in deze testsystemen van cellulaire eiwitten, die mogelijks betrokken zijn bij het integratieproces van HIV-1 in het gastheergenoom. Daarom proberen wij een cellulair integratiesysteem te ontwikkelen. Dergelijk systeem zou kunnen helpen in de celbiologische studie van het HIV-1 integratieproces en zou uiteindelijk ook kunnen gebruikt worden als evaluatiesysteem in onze zoektocht naar nieuwe inhibitoren die selectief interfereren met de HIV-1 integratie. Bij de aanvang van dit doctoraat waren reeds stabiele cellijnen (293T-INS) voorhanden in het laboratorium, die constitutief HIV-1 integrase tot expressie brengen vanaf een synthetisch gen (Cherepanov et al, 2000). Tijdens dit doctoraatsproject werden DNA substraten gekloneerd (het zogenaamde mini-HIV DNA) die naast de terminale HIV-1 U3-U5 sequenties ook een EGFP reportergen bevatten, wat deevaluatie van de transfectie-efficiëntie vergemakkelijkte. Deze substraten werden gebruikt om te evalueren of het IN, aanwezig in de cellen, de integratie van getransfecteerd lineair DNA kon bevorderen. Na electroporatie van dit mini-HIV DNA observeerden we een 2- tot 3-voudige stijging in EGFP expressie in de cellen die integrase tot expressie brachten, in vergelijking met een controle cellijn. Deze stijging was ook nog waarneembaar na passage van de cellen. Aangezien dit effect enkel werd verkregen na transfectie van lineair DNA en niet van circulair DNA, kon een algemeen effect op DNA opname worden uitgesloten. Verrassend was het feit dat de EGFP expressie telkens het hoogst was in de 293T-INS(D64V) cellen, die de katalytisch inactieve IN mutant tot expressie brengen. Zoals aangetoond met Q-PCR was dit effect in de mutante cellijn te wijten aan een verhoogde hoeveelheid mini-HIV DNA in de cellen alsook aan een toename in U3-U5 cirkels, wat wijst op een hogere concentratie aan mini-HIV DNA in de nucleus. Onze resultaten suggereren derhalve dat het HIV-1 integrase, dat stabiel tot expressie wordt gebracht in de cellen, interageert met het getransfecteerd DNA en het zodoende beschermt tegen nuclease afbraak, maar dat het integrase op zich niet in staat is de integratie als dusdanig te katalyseren. Ook al kan de huidige versie van de test niet worden gebruikt als cellulair evaluatiesysteem voor potentiële IN inhibitoren, zal dit cellulair integrase systeem in de toekomst gebruikt worden voor een meer gedetailleerde analyse van de interactie tussen HIV integrase en het DNA, met behulp van fluorescent gemerkte DNA substraten. Daarnaast kan deze test ook worden ingeschakeld in de studie van de rol van virale encellulaire co-factoren. Zoals reeds vermeld, is de integratie van HIV-1 een vrij complex proces: de nucleaire translocatie van het HIV-1 preïntegratiecomplex en de insertie van het viraal DNA in het gastheerchromosoom worden niet alleen gemedieerd door het viraal integrase, maar hoogstwaarschijnlijk ook door nog ongekarakteriseerde cellulaire co-factoren. Recent werd in ons laboratorium door Dr. P. Cherepanov de transcriptionele co-activator LEDGF/p75 geïdentificeerd als bindingspartner van HIV-1 integrase (Cherepanov et al, 2003). Gedurende dit doctoraat werd de rol van LEDGF/p75 tijdens de virale replicatie geanalyseerd. Dit onderzoeksproject werd uitgevoerd in nauwe samenwerking met de onderzoeksgroep van Dr. R. Benarous (Institut Cochin, Parijs). Met behulp van verschillende onderzoekstechnieken, zoals two-hybrid interactie studies, RNA interferentie, Q-PCR technologie, mutagenese, konden we aantonen dat zowel de onderdrukking van de LEDGF/p75 expressie via siRNA als de creatie van HIV-1 integrase mutanten, defectief voor de interactie met LEDGF/p75, resulteerden in een verminderde HIV-1 replicatie. De interactie tussen LEDGF/p75 en HIV-1 integrase blijkt dus belangrijk voor een efficiënte HIV-1 integratie en replicatie. Verder onderzoek zal moeten uitwijzen of LEDGF/p75 inderdaad een mogelijk nieuw antiviraal doelwit kan zijn voor de bestrijding van de HIV-1 infectie. At the end of 2004, the UNAIDS reported more than 40 million people infected by the human immunodeficiency virus (HIV), the causative agent of acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Despite the possibility to increase the life expectancy of HIV-infected persons by the current combination therapy, it is still not possible to completely eradicate the virus once infection is established. Furthermore, the emergence of multi-drug resistant virus strains in patients treated with the potent combination regimen demonstrates the need for further research on antiviral therapy against HIV-1 infection. The search for compounds inhibiting alternative steps of the viral replication cycle is important to reduce the viral potential to become multi-resistant. Permanent efforts are being made to keep on developing better and cheaper drugs which are available for everyone, including people from developing countries. The currently used antiretroviral drugs target the fusion of the virus with the host cell, the reverse transcription and the proteolytic cleavage of the polyproteins during maturation of the virions. During the life cycle of HIV-1, the integration process is a crucial step to obtain a productive infection and, therefore, can be considered as a point of no return. Hence, integration represents an attractive target for anti-HIV therapy. At the start of my doctorate work in 2000, more than 10 years of large-scale screening programs for integrase inhibitors had led to the identification of only one series of compounds, capable of selective inhibition of the integration step during viral replication in cell culture, namely the diketo acids (Hazuda et al, 2000). On the other hand, though, a lead compound, V-165, of a new series of potential IN inhibitors, the pyranodipyrimidines (PDPs) (Pannecouque et al, 2002), was at an early stage of preclinical development in our laboratory at that same moment. Besides the high-throughput screening of possible integrase inhibitors it is essential to obtain a good knowledge of the very complex mechanism of the integration process, involving viral as well as cellular proteins. Although the majority of potential integrase inhibitors has been identified using the in vitro oligonucleotide-based assays and has been further evaluated by indirect cellular-based methods, it was obvious at the beginning of this doctoral project, that the IN research field needed a more unambiguous assay to analyze the integration process and to evaluate the potential inhibitors more directly in cell culture. During this doctorate study I have introduced the real-time quantitative PCR (Q-PCR) technology in the laboratory. Optimization of three Q-PCRs employing different specific primers-probe sets, partially based on the paper of Butler et al. (2001), enabled us to quantify the three major viral DNA species formed during the viral life cycle: the total viral DNA , the 2-LTR circles and the integrated viral DNA. Asa result, it was possible to follow the kinetics of the viral replication cycle, since each different viral DNA form corresponds to a certain early key step of the HIV-1 life cycle ( reverse transcription, nuclear import and integration). The real-time quantification of integrated viral DNA, in particular, turned out to be an important assay to follow the integration of the viral genome into the host chromosome and to validate unequivocally the integration step as antiviral target in cellculture for in vitro identified candidate IN inhibitors. This real-time Q-PCR methodology was applied to different research areas in our laboratory and proved to be a useful tool. As for vectorology, the real-time Q-PCR assays have beenused to study the impact of the central polypurine tract on the kinetics of lentiviral vector transduction. Lentiviral vectors derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) show great promise as gene carriers for future gene therapy. Incorporation of a fragment containing the central polypurine tract (cPPT) in the HIV-1 vector constructs is known to enhance transduction efficiency drastically, reportedly by facilitating the nuclear import of HIV-1 cDNA through a central DNA flap (Zennou et al, 2000; Follenzi et al, 2000). During this study, the kinetics of total HIV-1 DNA, 2-LTR circles and integrated proviral DNA were followed by real-time Q-PCR. About 6 to 12 hrs after transduction the total HIV-1 DNA reached a maximum level, followed by a steep decrease. The 2-LTR circles peaked after 24-48 hrs and were diluted upon cell division. Integration of HIV-1 DNA was first detected at 12 hrs post infection. When HIV-1 vectors were used that contained the central polypurine tract (cPPT), DNA synthesis was similar but a 3-fold higher amount of 2-LTR circles was detected, confirming the impact on nuclear import. Moreover, a 10-fold increase in the amount of integrated DNA was observed in the presence of the cPPT. Only in the absence of the cPPT, saturation in 2-LTR circle formation was seen at a high multiplicity of infection, suggesting a role for the cPPT in overcoming a barrier to nuclear import of HIV-1 DNA. A major effect of the central DNA flap on the juxtaposition of both LTRs is unlikely since transduction with HIV-1 vectors containing ectopic cPPT fragments resulted in increased amounts of 2-LTR circles as well as of integrated DNA. The introduction of the cPPT in the lentiviral vector genome is clearly an improvement in the gene therapy field. Further optimization of lentiviral vectors will certainly be required before entering safely into the clinic. The real-time Q-PCR will be a helpful tool during the future optimizations. To corroborate the usefulness of