Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Lysozymes zijn enzymen die de hydrolytische splitsing katalyseren van peptidoglycaan, debelangrijkste structurele component van de bacteriële celwand. Door de celwand teverzwakken kunnen lysozymes bacteriën lyseren en hebben ze een belangrijke plaats in hetaangeboren immuunsysteem van dieren Om zich te wapenen tegen deze antimicrobiëleenzymen hebben sommige bacteriën zoals Escherichia coli en Salmonella specifiekeinhibitorproteïnen ontwikkeld die de werking van de lysozymes neutraliseren. Zo is reedsgeruime tijd geweten dat E. coli stammen twee inhibitor types produceren gericht tegen hetconventionele type lysozym (c-type, waartoe het humane lysozym behoort), enerzijdsInhibitor van vertebrate lysozym (Ivy) en anderzijds Membraangebonden lysozyminhibitorvan c-type lysozyme (MliC). Recent werd echter ontdekt dat bepaalde pathogene E. colistammen eveneens een PliC-homoloog (Periplasmatische lysozyminhibitor van c-typelysozyme) bezitten. De hoofdtaak van deze thesis omvat de karakterisatie van dit PliC in deAviare Pathogene Escherichia coli stam APEC CH2. In een eerste deel werd PliC van APECCH2 recombinant tot expressie gebracht waarbij het voorzien werd van een His-tag, enopgezuiverd werd via Ni2+ affiniteitschromatografie. Vervolgens werd het inhibitiespectrumvan de opgezuiverde inhibitor onderzocht waarbij geconcludeerd kon worden dat PliC vanAPEC CH2 een specifieke c-type lysozyminhibitor is. In een tweede deel werd getracht debijdrage van PliC tot de lysozymresistentie van de APEC CH2 stam na te gaan. Hiervoorwerd een pliC knock-out van APEC CH2 gemaakt en een permeabilisatie-experimentuitgevoerd om te kijken in welke conditie het buitenmembraan van APEC CH2 het meestdoorlaatbaar werd. Deze conditie werd dan vervolgens aangewend in een inactivatieexperimentwaarbij de gevoeligheid van de knock-out stam vergeleken werd met de wild typestam. Uitschakeling van pliC resulteerde wel degelijk in een verhoging van delysozymgevoeligheid van de APEC CH2 stam. Om naa...

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Autotransporters (ATs) vertegenwoordigen een grote familie van gesecreteerde en celoppervlakgeassocieerde eiwitten in Gram-negatieve bacteriën. Ze zijn opgebouwd uit een N-terminale signaalsequentie, een functioneel passagiersdomein, een α-helicale linkerregio en een C-terminale b-barrel die instaat voor insertie in de buitenmembraan. Omwille van hun schijnbaar eenvoudig secretiemechanisme en hun modulaire structuur worden ATs vaak voorgesteld als universeel en breed toepasbaar systeem voor de presentatie van heterologe eiwitten aan het oppervlak van bacteriële cellen. Recent onderzoek heeft echter aangetoond dat de toepasbaarheid van AT-gebaseerde oppervlaktepresentatie beperkingen kent. In deze masterproef wordt onderzocht welke intrinsieke eigenschappen van heterologe passagierseiwitten kunnen interfereren met oppervlaktepresentatie door de esterase A (EstA) AT van Pseudomonas stutzeri A15. In een eerste fase werd een grondige literatuurstudie uitgevoerd waaruit bleek dat driemaal meer gesecreteerde dan niet-gesecreteerde eiwitten gepresenteerd zijn aan het celoppervlak met behulp van ATs. In een tweede fase werd de invloed van de oorspronkelijke cellulaire lokatie van passagierseiwitten op de oppervlaktepresentatie met behulp van de EstA AT van P. stutzeri A15 experimenteel nagegaan. Hiertoe werden zeven extracelullaire, zes periplasmatische en vijf cytoplasmatische eiwitten van Pseudomonas aeruginosa PAO1 gefuseerd aan de translocatieeenheid van de EstA AT van P. stutzeri A15. Productie en oppervlaktepresentatie van de fusieproteïnen in P. stutzeri A15 werden onderzocht door behandeling van intacte cellen met proteïnase K. Verder werd de cellulaire lokalisatie van de fusieproteïnen nagegaan door middel van celfractionatie. Hierbij werd ook de‘heat modifiability’ van de fusieproteïnen in de membraanfractie getest om de aanwezigheid van een b-barrel structuur na te gaan. Overeenkomstig met de bevindingen uit een voorgaande studie, werd de meerderhei...