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Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV of “Theiler’s virus”) is a murine Picornavirus, member of the Cardiovirus genus. Strains of Theiler’s virus are classified into two subgroups according to the pathology caused by these viruses when they reach the central nervous system of their host: either acute neurovirulence or viral persistence accompanied by a chronic demyelinating disease.
This work aimed to analyze the subcellualr localization of the 2A protein encoded by Theiler’s virus with the hope to collect some hint about the function of this protein. Little is know about the role of this protein. Its C-terminal domain is know to participate tit ho maturation cleavage occurring between regions 2A and 2B the viral polyprotein. Except for this C-terminal domain, protein 2A was shown to be dispensable for replication of the viral genome. Using immunofluorescent labelling with a polyclonal anti-2A antibody, we showed that protein 2A can be present in both the cytoplasmic and nuclear compartments of infected cells. Part of the cells exhibited a clear staining of protein 2A in the nucleoli. Nucleolar localization of protein 2A was confirmed by co-localization of this protein with the nucleolar B23 protein, as assessed by confocal microscopy.
Infection of cells with mutant viruses showed that nucleolar targeting of protein 2A is independent of the presence of the viral L protein with which it might interact. A positively charged segment of protein 2A appears to be important for nucleolar targeting. However, 2A-eGFP fusion proteins failed to be detected in the nucleoli of transfected cells Le virus de Theiler fait partie du genre des Cardinovirus appartenant à la famille des Picornaviridae. Les différentes souches du virus de Theiler sont classées en deux sous-groupes, les souches neurovirulentes et les souches persistantes, selon la pathologie qu’elles induisent.
L’objet de ce mémoire était d’étudier la localisation subcellulaire de la protéine 2A codée par le virus de Theiler, dans l’espoir d’en tirer des informations sur la fonction de cette protéine. Pau de choses sont connues sur la protéine 2A. Elle est constituée de 133 acides aminés et participe au clivage co-traductionnel de la polyprotéine virale qui survient entre les protéines 2A/2B. Elle n’est pas indispensable pour la réplication du génome viral.
Par immuno-fluorescence à l’aide d’un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine 2A, nous avons montré que cette protéine peut être détectée dans le cytoplasme et le noyau des cellules infectées. De plus, la protéine 2A est détectée dans les nucléoles d’une proportion non négligeable de cellules. Cette localisation est confirmée par une co-localisation avec le protéine nucléolaire B23, observée en microscopie confocale.
L’utilisation de virus mutants indique que la localisation nucléolaire de la protéine 2A ne dépend pas de la présence de la protéine L du virus, avec laquelle elle pourrait interagir. Une région de la protéine 2A, riche en acides aminés chargés positivement, semble être requise pour l’adressage nucléolaire de cette protéine. Cependant, des fusions eGFP-2A et 2A-eGFP exprimées à partir de vecteurs d’expression ne montrent pas de localisation nuléolaire.
Enfin, nos données montrent que l’expression de la protéine 2A est toxique pour les cellules, bien que cette toxicité semble plus faible que celle de la protéine L. Les effets toxiques de ces deux protéines semblent s’additionner lorsque les deux protéines sont en présence

Theilovirus --- Virion

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Notre étude a contribué à mettre en évidence les effets d’un traitement chronique au valproate au niveau de différentes structures et composants subcellulaires de foie et de rein. Cet agent antiépoleptique hépatotoxique, qui a été incriminé dans la survenue d’accidents mortels, induit des perturbations métaboliques multiples. Une des plus importantes d’entre elles, déjà rapportée par de nombreux auteurs, est probablement l’inhibition de la β-oxydation mitochondriale. Diverses conséquences découlent de ce blocage. Tout d’abord, la production d’ATP par l’hépatocyte doit provenir en plus grande proportion d’autres voies, comme le cycle de Krebs. Nous avons montré que certaines enzymes de ce cycle étaient stimules par le valproate. L’important flux d’acides gras vers le foie doit trouver d’autres débouchés. Une partie d’entre eux reformera des triglycérides, qui, s’ils ne sont pas réexportés sous forme de VLDL, contribueront à la stéatose hépatique. On peut aussi imaginer que les voies alternatives du catabolisme des acides gras vont être stimulées. Il existe essentiellement deux voies métaboliques alternes : les acides gras peuvent subir la β-oxydation peroxysomiale, qui formera des acides gras à chaîne moyenne. Ils peuvent également être substrats de l’oméga-oxydation dont la première étape se fait au niveau du réticulum endoplasmique et nécessite le cytochrome P-450. les produits oméga, oméga-1 et oméga-2 hydroxylés pouvant, après oxydation en acides dicarboxyliques, être à leur tour substrats de la β-oxydation peroxysomiale.
Nous avons montré qu’un traitement au valproate avait un effet sur ces deux voies : non seulement il induit une prolifération peroxysomiale, mais encore il stimuler l’activité d’enzymes impliquées dans cette β-oxydation. En outre, nous avons suffisamment souligné son effet sur les cytochromes P-450 et b5, deux hémoprotéines impliquées dans l’oméga-oxydation des acides gras.
Ces premiers résultats nous ont permis d’entrevoir l’existence d’un lien entre les nombreuses perturbations biochimiques occasionnées par cet agent antiépileptique. Une analyse plus fouillée et des expériences complémentaires nous permettront sans doute de mieux comprendre les mécanismes responsables des manifestations toxiques observées. Nous pensons en premier lieu à des études enzymatiques sur préparation enrichies en organites intracellulaires et à une analyse chromatographique des acides gras microsomiaux. L’étude des mitochondries isolées permettrait de mieux préciser les effets sur les enzymes du cycle de Krebs et de la chaîne des phosphorylations oxydatives. Elle permettrait également de mesurer l’utilisation de substrats par ces organites, soit grâce à l’oxydation de ferricyanure de potassium, selon la technique d’Osmundsen & Bremer (1977). L(étude pourrait aussi porter sur une fraction enrichie en peroxysomes dans laquelle l’utilisation des acides gras, des oméga-hydroxyacides et des acides dicarboxyliques serait mesurée. L’étude d’une fraction enrichie en peroxysomes dans laquelle l’utilisation des acides gras, des oméga-hydroxyacides et des acides dicarboxyliques serait mesurée. L’étude d’une fraction enrichie en microsomes immobilisés soumis à un flux de substrats pourrait révéler l’importance métabolique de ce compartiment subcellulaire.
Une meilleure compréhension de l’effet du valproate sur l’oméga-oxydation s’avère indispensable : ce sujet est neuf et d’un intérêt tout particulier puisqu’on a montré que c’est par cette voie que sont produits les métabolites stéatogènes (Rettie et al., 1987).

Valproic Acid