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Introduction. Les plaquettes contrôlent l'hémostase en adhérant à l'endothélium en cas de lésion et en s'agrégeant. Les mécanismes mis en œuvre dans ce processus physiologique sont similaires à ceux responsables de la thrombose artérielle, une complication grave de l'athérosclérose qui peut mener à un infarctus du myocarde potentiellement mortel. Des données obtenues au laboratoire ont montré qu'une phosphorylation élevée et soutenue de l'acétyl-CoA carboxylase (ACC) est observée dans les plaquettes de patients souffrant d'une maladie coronaire athéromateuse. L'isoforme ACC1, majoritaire dans les plaquettes, est une enzyme clé de la lipogenèse qui peut être régulée par des modifications post­ traductionnelles. Sa phosphorylation inhibe son activité. Hypothèse. Étant donné l'importance du rôle joué par de nombreux lipides dans les plaquettes tant au niveau de substrats énergétiques que de molécules de signalisation, nous postulons qu'une modulation de la phosphorylation/activité de l'ACC pourrait altérer les fonctions plaquettaires (adhésion, activation, agrégation, rétraction du clou plaquettaire et activité pro-coagulante) et/ou le métabolisme énergétique, et par conséquent affecter la formation ou la stabilité d'un thrombus. Méthodes. Dans ce travail, nous avons utilisé un inhibiteur pharmacologique de l'ACC, le TOFA. Des plaquettes humaines ont été pré-incubées en présence de TOFA 30µM pendant 2 heures puis stimulées avec de la thrombine. Nous avons mesuré la lipogenèse via l'incorporation de 14C-acide acétique dans les lipides. Les fonctions plaquettaires ont été mesurées par agrégométrie, cytométrie de flux et microscopie. L'expression et la phosphorylation de certains médiateurs de signalisation ont été examinées par western blot. Le métabolisme des plaquettes a été évalué via la mesure de la consommation d'oxygène. Résultats. Nos résultats montrent que le TOFA diminue la lipogenèse dans les plaquettes. Cette diminution est associée à une altération de la morphologie, à une inhibition de la sécrétion des granules denses et de l'agrégation plaquettaire induites par la thrombine tandis que l'activation du récepteur a.IIbJ33 et la sécrétion des granules a ne sont pas affectés, suggérant que le défaut d'agrégation provient d'une diminution des effets autocrines et paracrines de l'ADP et de l'ATP. Nous montrons que les mécanismes impliqués dans la diminution de la sécrétion des granules denses font intervenir les PKC, notamment la PKCδ, et leurs substrats, la cytohésine-2 et la PKD. De plus, nos résultats suggèrent qu'une diminution du contenu en phosphatidylsérine pourrait contribuer, en partie, à l'inhibition des PKC. À côté de son impact majeur sur la signalisation des plaquettes, le TOFA affecte aussi leur métabolisme énergétique en diminuant la capacité de réserve respiratoire et la respiration mitochondriale liée à la production d'ATP. Conclusion. Notre étude démontre qu’une inhibition soutenue de l’ACC diminue la lipogenèse et affecte la sécrétion des granules denses et l’agrégation via un ou plusieurs mécanismes dépendant des PKC et du métabolisme énergétique. Nous pensons que cela pourrait affecter la stabilité du thrombus chez les patients athéromateux. Introduction: Platelets adhere to the endothelium of vessels when there is a breach and lead to the formation of a clot. By this phenomenon, platelets control hemostasis. Mechanisms involved in this physiological process are similar to those responsible for arterial thrombosis that is a severe complication of atherosclerosis. This disease can lead to myocardial infarction and death. Acetyl-CoA carboxylase (ACC) regulates fatty acids synthesis and oxidation. Previous results from the lab showed that ACC is phosphorylated in platelets from patients with coronary artery disease, potentially due to persistent thrombin generation. ACC phosphorylation results in its inhibition. Aims: Given the primary roles of lipids in platelets structure, energy storage and signaling, we hypothesized that a sustained inhibition of ACC could have consequences on platelets activation and bioenergetics. Methods: To test our hypothesis, platelets were treated with 30µM TOFA, an ACC inhibitor, for 2 hours before thrombin stimulation. We measured lipogenesis via l4C-acetate incorporation into fatty acids. Platelet functions were assessed by aggregometry and flow cytometric studies. Signaling mediators were evaluated by western blot and platelet mitochondrial function was reflected by the oxygen consumption rate. Results: We show that a pre incubation of platelets with TOFA significantly decreased lipogenesis (Control: 6 pmol/min/10 9 platelets ± 0.8; TOFA: 1 pmol/min/10 9 platelets ± 0.3; P<0.05). This effect was accompanied by a significant defect in dense granules secretion and aggregation in response to Iow thrombin concentrations, whereas u-granules secretion was not affected, suggesting that the default in aggregation likely resulted from a lower autocrine and paracrine role of ADP. PKC activity is essential for granule secretion. Accordingly, we show that TOFA significantly decreased PKC substrates phosphorylation in baseline and after thrombin stimulation. Since PKCδ has been shown to play a role in dense granules regulation, the effects of TOFA on its activity was evaluated through the analysis of VASP phosphorylation. Indeed, inhibition of PKCδ has been shown to promote hyper phosphorylation of its Serl57 in platelets. Treatment with TOFA led to a drastic increase of Serl57 phosphorylation, in baseline and after thrombin stimulation, and in a cAMP-independent way. In addition, TOFA treatment significantly decreased phosphorylation of cytohesin-2 and PKD, two PKC substrates playing a critical role in dense granules secretion. Platelet metabolism was also affected by a sustained ACC inhibition, as shown by the TOFA-induced decrease in reserve capacity and ATP-linked respiration. Conclusion: Our study shows that a sustained inhibition of platelet ACC decreases lipogenesis and affects (i) dense granule secretion and aggregation through a PKC/ PKCδ - dependent mechanism, and (ii) platelet bioenergetics. We believe that it could affect thrombus stabilization in atherosclerotic patients.

Acetyl-CoA Carboxylase --- Platelet Function Tests

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Myocardial infraction occurs when blood flow to destination of the heart muscle is insufficient. This decrease is due to partial or complete occlusion of coronary arteries by atherosclerotic plaque and/or thrombus. To ensure a flow rate adapted to the metabolic needs of the body, the heart changes its structure through a complex process called ventricular remodelling. Remodelling is characterized by a ventricular dilation, an hypertrophy of cardiomyocytes and the development of a reparative and reactive fibrosis. Initially beneficial, it eventually leads to ventricular dysfunction and heart failure. Cardiac fibroblasts represent 60-70% of the total cellular population of the heart. They play a fundamental role in cardiac physiology by ensuring the structural integrity of the heart through a controlled turnover of the extracellular matrix. After myocardial infarction, various stimuli lead to their proliferation and differentiation in hyper-metabolic cells (the myofibroblasts). Angiotensin II (AgII) and Transforming Growth Factor β (TGFβ) are key mediators of these processes. These molecules activate several signaling pathways (MAPK, Smad, RhoA/ROK, NADPH axidase) resulting in stimulation of profibrotic gene expression. Several studies have shown that AMP-activated protein kinase (AMPK) could interact with these pathways and control cellular processes such as proliferation/apoptosis and differentiation. In this work, we have studied the role of AMPK in human cardiac fibroblast myodifferentiation. Through the use of AMPK-α1 knockout mice (KO), we have also investigated the role of this protein kinase in vivo, in the development of fibrosis after myocardial infarction. These mice have been subjected to coronary ligation causing a myocardial infarction. The expression of fibrotic genes has been measured by qRT-PCR in the infarcted and the remote zone isolated from wild-type (WT) and KO hearts. Meanwhile, cardiac function has been assessed by echocardiography. We show increased expression of collagen I and III, “Plasminogen Activator Inhibitor-1 (PAI-1) and the “connective tissue factor (CTGF) in the infarcted region of hearts from KO mice versus WT mice (similar basal expression level). By contrast, there is no significant change of expression in the remote zone. By echocardiography, we show a greater ventricular dilation on KO mice, compared with WT mice. Our results argue for a protective role of AMPK as regards of cardiac fibrosis and remodelling and are consistent with the data obtained in cultured human cardiac fibroblasts. In this model, we show that TGFβ-1 changes cell morphology and increases to about twice the level of expression of the alpha isoform smooth muscle actin (α-SMA), a marker of myodifferentiation. Preincubation with the A-769662 compound, a pharmacological activator of AMPK, prevents these changes. Phosphorylation of Smad3 induced by TGF-β1 is also reduced in these conditions and could contribute to the anti-fibrotic affects of AMPK activation in the infarcted heart L’infarctus du myocarde survient lorsque le flux sanguin à destination du muscle cardiaque est insuffisant. Cette diminution est due à l’occlusion partielle ou complète des artères coronaires par une plaque d’athérosclérose et/ou d’un thrombus. Afin d’assurer un débit adapté aux besoins métaboliques de l’organisme, le cœur modifie sa structure par un processus complexe appelé remodelage ventriculaire. Le remodelage est caractérisé par une dilatation de la chambre ventriculaire, une hypertrophie des cardiomyocytes et le développement d’une fibrose cicatricielle et interstitielle. Initialement bénéfique, il finit par entraîner une dysfonction ventriculaire qui peut conduire à long terme à une insuffisance cardiaque chronique. Les fibroblastes cardiaques représentent 60-70 % de la population cellulaire du cœur. Ils jouent un rôle fondamental dans la physiologie cardiaque en assurant le maintien de l’intégrité structurale du cœur à travers une prolifération contrôlée et un turnover de la matrice extracellulaire. Après un infarctus du myocarde, divers stimuli entraînent leur prolifération et leur différenciation en cellules hyper-métaboliques (les myofibroblastes). L’ angiotensine II (AgII) et le «Transforming Growth Factor β» (TGFβ) sont des médiateurs clés de ces processus. Ces molécules activent plusieurs voies de signalisation (MAPK, Smad, RhoA/ROK, NADPH oxydase) qui aboutissent à la stimulation de l’expression des gènes profibrotiques. Plusieurs études ont montré que l’AMP-activated protein kinase (AMPK) pouvait interagir avec certains de ces éléments de signalisation et contrôler des processus cellulaires comme la croissance, la prolifération/différenciation et l’apoptose. Dans ce travail de mémoire, nous avons étudié le rôle de l’AMPK dans la myodifférenciation des fibroblastes cardiaques humains. Grâce à l’utilisation de souris transgéniques AMPK α1-knockout (KO), nous avons également investigué le rôle de cette protéine kinase in vivo, dans le développement de la fibrose myocardique post-infarctus. Ces souris ont été soumises à une ligature de la coronaire provoquant un infarctus du myocarde. L’expression de plusieurs gènes fibrotiques dans les régions saine et infarcie du ventricule gauche a été mesurée par qRT-PCR. Parallèlement, la fonction cardiaque a été évaluée par échocardiographie. Nous montrons une expression augmentée de collagène I et III, du «Plasminogen Activator Inhibitor-1 » (PAl-1) et du «Connective Tissue Factor» (CTGF) dans la région infarcie des cœurs de souris KO versus la région infarcie des cœurs de souris contrôles (WT) (niveau d’expression basal similaire). Par contre, il n’y a aucun changement significatif d’expression dans la région saine des souris WT et KO. Les résultats de l’analyse échocardiographique montrent une dilatation du ventricule plus importante chez les souris KO, par rapport aux souris WT. Ces résultats, en faveur d’un rôle protecteur de l’AMPK vis-à-vis de la fibrose et du remodelage, sont en accord avec les données obtenues in vitro, dans des cultures de fibroblastes cardiaques humains. Nous montrons que le TGFf3-l modifie la morphologie des cellules et augmente d’environ deux fois le niveau d’expression de l’isoforme alpha de l’actine musculaire lisse (αSMA), un marqueur de myodifférenciation. Une préincubation avec le composé A-769662, un activateur pharmacologique de 1’AMPK, empêche ces changements. La phosphorylation de Smad3 induite par le TGFβ- 1 est également diminuée dans ces conditions et pourrait contribuer aux effets anti-fibrotiques d’une activation de 1’AMPK dans le cœur infarci

Myocardial Infarction --- Heart --- Transforming Growth Factors

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The vascular injuries are responsible for most of the morbidity and mortality observed in diabetics. Chronic hyperglycemia is clearly recognized as the main culprit. Oxidative stress is an important pathogenic factor. It causes structural and functional alterations of endothelial cells. In this work, we focused on the molecular mechanisms. By which high glucose concentrations result in structural changes of the endothelium. These changes are the result of a rearrangement of the actin cytoskeleton and an increase in its contractility. In healthy endothelium, a dense network of cortical actin ensure the maintenance of intercellular adhesion in the endothelial monolayer that forms in this way a dynamic semipermeable barrier between the circulation and surrounding tissues. The contraction of the actin cytoskeleton decreases the adhesion between cells and therefore increases trans-endothelial permeability. Among the physiological agents that can affect vascular permeability, thrombin is an interesting case. Indeed, this protease is not only involved in controlling blood clotting. It can also modulate the function and structure of the endothelium. In physiological conditions, its effect on concentration of the cell cytoskeleton is offset by the massive release of NO (nitric oxide) which results in relaxation of underlying smooth muscle. This balance between contraction-relaxation ensures the integrity of the endothelial barrier. In contrast, in pathological conditions (diabetes or sepsis), the resulting oxidative stress causes a decrease in the availability of NO and breaks the balance in favour of cell contraction. The vascular permeability is dramatically increased (pro-coagulant state of the endothelium and leakage of plasma into the perivascular space).
The molecular mechanisms by which thrombin exerts its effect on the structure of endothelium are similar to those of hyperglycemia and involve the phosphorylation of several cytoskeleton targets. We focused on two axes of regulation controlling contractility and actin polymerisation, respectively: the axis RhoA/ROK (Rho-associated protein kinase) and the axis p38MAPK/HSP27. The activation of these signalling pathways by thrombin also induces the activation of the AMP-activated kinase (AMPK) in the endothelial cells. The importance of this activation in the control of the architecture of the endothelial cells has been suggested. We also investigated the potential interference of this protein kinase with RhoA and HSP27 signalling.
Our results show that high glucose activates RhoA/MLC axis and potentiates the effects of thrombin, at least on RhoA. Phosphorylation of HSP27 is less sensitive to extracellular glucose concentration. We also show that AMPK, activated in response to thrombin, prevents RhoA/MLC activation and phosphorylation of HSP27. We propose that the activation of eNOS and NO production may be the mechanism by which AMPK inhibits phosphorylation of HSP27 is not yet understood Les lésions vasculaires sont responsables de l’essentiel de la morbidité et de la mortalité observées chez les diabétiques. L’hyperglycémie chronique est clairement reconnue comme le coupable principal. Le stress oxydatif en est un élément pathogénique important. Il est à l’origine des altérations fonctionnelles et structurelles des cellules endothéliales. Dans ce travail, nous nous sommes focalisés sur les mécanismes moléculaires par lesquels de hautes concentrations en glucose entraînent des modifications structurelles de l’endothélium. Ces modifications sont le résultat d’un réarrangement du cytosquelette d’actine et d’une augmentation de sa contractilité. Dans l’endothélium sain, un réseau dense d’actine corticale assure le maintien de l’adhésion inter-cellulaire au sein de la monocouche endothéliale qui forme de cette façon une barrière dynamique semi-perméable entre la circulation et les tissus environnants. La contraction du cytosquelette d’actine diminue l’adhésion des cellules entre elles et augmente par conséquent la perméabilité trans-endothéliale. Parmi les agents physiologiques capables d’affecter la perméabilité vasculaire, la thrombine est un cas intéressant. En effet, cette protéase n’est pas seulement impliquée dans le contrôle de la l’endothélium. En condition physiologique, son effet sur la contractilité du cytosquelette cellulaire est compensé par la libération massive de NO (monoxyde d’azote) qu’elle entraîne et qui induit la relaxation du muscle lisse sous-jacent. Cet équilibre contraction-relaxation assure l’intégrité de la barrière endothéliale. Par contre, en condition pathologique (diabète ou sepsis), le stress oxydatif qui en découle provoque une diminution de la disponibilité du NO et rompt l’équilibre en faveur de la contraction cellulaire. La perméabilité vasculaire est dramatiquement augmentée (état pro-coagulant de l’endothélium et fuite de plasma dans l’espace péri-vasculaire).
Les mécanismes moléculaires par lesquels la thrombine exerce son effet sur la structure de l’endothélium sont similaires à ceux de l’hyperglycémie et impliquent la phosphorylation de plusieurs éléments de contrôle du cytosquelette. Nous nous sommes intéressés à deux axes de régulation, contrôlant respectivement la contractilité et la polymérisation de l’actine : l’axe RhoA/ROK (Rho-associated protein kinase) et l’axe p38MAPK/HSP27. L’activation de ces deux voies de signalisation par la thrombine induit également l’activation de l’AMP-activated protein kinase (AMPK) dans les cellules endothéliales. L’importance de cette activation dans le contrôle de l’architecture de la cellule endothéliale a été suggérée. Nous avons également investigué l’interférence potentielle de cette protéine kinase avec les axes de signalisation étudiés.
Nos résultats montrent que le haut glucose active l’axe RhoA/MLC et potentialise les effets de la thrombine, au moins sur RhoA. La phosphorylation d’HSP27 est moins sensible à la concentration de glucose extracellulaire. Nous montrons également que l’AMPK, activée en réponse à la thrombine, s’oppose à l’activation de RhoA/MLC et à la phosphorylation d’HSP27. Nous proposons que l’activation de eNOS et la production de NO pourrait être le mécanisme par lequel l’AMPK contrôle l’activité de RhoA dans les cellules endothéliales. Le mécanisme par lequel l’AMPK inhibe la phosphorylation d’HSP27 n’est pas encore élucidé

Thrombin --- Diabetes Mellitus --- AMP-activated protein kinases --- Hyperglycemia --- Oxidative Stress --- Endothelial Cells