Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Een stap in de goede richting voor Alzheimer onderzoek Alzheimer, de meeste mensen kennen wel iemand die met deze toetakelende ziekte te kampen heeft. Daarenboven zal het aantal getroffen mensen alleen maar toenemen, aangezien we steeds ouder worden. Aan de andere kant zullen we dan kunnen rekenen op minder (financiële) steun, vanwege de vergrijzing. Zo ziet de situatie er nu alleszins uit, maar wat als er medicatie zou kunnen worden ontwikkeld die Alzheimer kan voorkomen, genezen, of een halt toeroepen? Alzheimer wordt veroorzaakt door het afsterven van neuronen (zenuwcellen) in de hersenen. Daarenboven wordt het gekenmerkt door de aanwezigheid van zogenaamde neurofibrillaire ‘klitten’ die een proteïne genaamd Tau bevatten. Er worden dus als het ware kluwens van samengeklit Tau gevormd, waardoor deze proteïne zijn functie niet meer kan uitoefenen of misschien zelfs toxisch wordt. Dit is een probleem, aangezien Tau een noodzakelijke rol speelt in het functioneren van neuronen. Tau kan gemakkelijk van structuur veranderen en kan daardoor fase scheiding ondergaan, waarbij verschillende Tau proteïnen groeperen in vloeistof-achtige druppeltjes. Hoewel deze druppeltjes een normale functie zouden kunnen hebben, zouden ze ook een overgang kunnen representeren van ‘gezond’ Tau naar pathologisch Tau. Daarnaast blijkt ook de fosforylatie van Tau, met andere woorden, het toevoegen van fosfaatgroepen, geassocieerd te zijn met pathologische functies. Wij trachtten te onderzoeken of de fosforylatie van Tau op bepaalde locaties een effect heeft op de structuur en het fase scheiding gedrag van deze proteïne. Dit werd gedaan door middel van het nabootsen van fosforylatie. Aangezien Tau vaak van structuur verandert, is het moeilijk om deze te bestuderen met klassieke technieken. Daarom gebruikten wij een techniek waarbij we de afstand tussen bepaalde locaties van de moleculen kunnen meten. Aangezien de afstand tussen slechts twee verschillende locatie-paren werd getest, konden er weinig conclusies getrokken worden betreffende de structuur van de proteïne. Er waren echter wel aanwijzingen dat fosforylatie zorgt voor meer dynamische proteïnen. Deze zouden meer switchen tussen verschillende structuren. Daarnaast zagen we dat er grotere druppeltjes gevormd werden bij Tau waar fosforylatie bij werd nagebootst. Dit zou het gevolg kunnen zijn van de extra negatieve ladingen die aanwezig zijn in deze proteïne, waardoor de interacties binnen en tussen moleculen zouden kunnen veranderen. Deze bevindingen dragen bij aan het beter begrijpen van hoe Alzheimer tot stand komt, wat op zijn beurt kan bijdragen aan de ontwikkeling van medicatie.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Targeting of proteins to specific organelles, to membranes or to the extracellular environment is a ubiquitous and essential biological process in all life forms, from bacteria to higher Eukaryotes and engages more than 30% of the proteome. In bacterial cells such as E.coli, the Sec translocase system is responsible for translocation of a large quantity of secreted (~500) and integrated membrane proteins (~1100). The Sec system is viewed as a model system, because of his structural and functional similarity with eukaryotic sorting systems. Besides, it is a challenging target for antibacterial therapy since it is essential for the liveability of bacteria. In general, Sec comprises a conserved protein-conducting channel, the SecYEG heterotrimer, which associates with cytoplasmic partners that thread polypeptides through it and provide the required energy. In the post-translational translocation route taken by secretory proteins, the partner is the dimeric peripheral ATPase motor SecA, which shuttles between the cytoplasm and membrane. SecA recognizes secretory peptides and attracts them to the channel. Because of their evolutionary connection with the endoplasmatic reticulum (ER) translocon, Sec proteins have been the subject of many studies. What is generally lacking in the protein targeting/secretion field is knowledge on the mechanistic of the recognition of targeting signals. Another major remaining challenge is to determine the exact mechanism by which chains cross the membrane. Better insights in the Sec mechanisms is essential (i) to verify the fundamental aspects of protein sorting and (ii) to support the target-based research for possible inhibitors of protein sorting. Since protein conformation and conformational dynamics seems to be the key to the function of translocases, there is an essential need of methods to study conformations at a quantitative manner. Those methods prefer working at the single-molecule level to study heterogeneity in populations of biomolecules. Besides those methods needs to be performed at biological relevant conditions to minimally disturb the molecular function. Specific for this project, the main objectives are the development of innovative quantitative fluorescence microscopy techniques to study dynamic conformation wobbling in vitro and dynamic structures in vivo at a quantitative manner. Those methodology will in this work be applied on detailed study of the E. coli Sec reaction pathway. More specific we will study the SecA ATPase motor protein in detail. It is important to complement structural and consisting biophysical methods with advanced imaging methods to achieve both qualitative and quantitative information. The project will be divided in four work packages : (i) Single-pair Förster resonance energy transfer (spFRET) on a multiparameter fluorescence detection microscope (MFD) combined with pulsed interleaved excitation (PIE), (ii) Mechanistic of substrate recognition of SecA, (iii) mechanism of substrate translocation at SecYEG and (iv) biophysical analysis of the Sec pathway in vivo using super resolution methods and fluctuation imaging methods. This project bridges the field of molecular microbiology research and single-molecule microscopy. This is the first time a collaboration has been established between the Laboratory for Photochemistry and Spectroscopy (LPS) and the Laboratory of Molecular Bacteriology (LMB). At the LPS (Hofkens, Hendrix) the expertise exists to set up a platform for carrying out exactly such technical developments. Likewise, research at the LMB (Economou) is at a point where state-of-the-art biochemical/-physical methods are available to support the required biological developments. The fundamental knowledge gained about the cellular protein sorting and secretion in bacteria can result in new targets for the antibiotic industry. At the same time, new state-of-the-art methods will be developed (MFD-PIE platform) which can be used for internal and external research with different purposes, such as research on conformation, dynamics and interactions of molecules.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

De ontwikkeling van fluorescente eiwitten (FP's) laat ons toe om met behulp van fluorescentie microscopie bepaalde eiwitten te bestuderen in cellen. Fluorescentie microscopie maakt gebruik van specifieke lichtbronnen om deze eiwitten te doen fluoresceren. Eerder had men al fluorescerende eiwitten met verschillende kleuren ontdekt en/of ontwikkeld zoals blauw, cyaan, geel, groen en rood. Deze zijn reeds getest voor het bestuderen van eiwitten in cellen. Recent werden bijna-infrarode fluorescente eiwitten ontwikkeld (NIRFP's), welke mogelijk eveneens kunnen dienen als fluorescente merkers en die vervolgens de mogelijkheid bieden om ook twee of meer verschillende eiwitten tegelijkertijd te visualiseren. Dit in combinatie met veelgebruikte fluorescente eiwitten zoals een groen fluorescerend eiwit, eGFP en/of een rood fluorescerend eiwit, mCherry. Het algemene doel van dit project is om de toepasbaarheid van fluorescentie fluctuatie beeldvorming met deze NIRFP's te onderzoeken. Hierbij werd gebruik gemaakt van een fluctuatie beeldvorming techniek, genaamd RICS, omdat het een voorkeursmethode is om informatie te verkrijgen over de beweging en eveneens om interacties tussen eiwitten te bestuderen. Deze methode maakt gebruik van statistische berekeningen om herhalende fluorescentie fluctuatie patronen van deze fluorescerende eiwitten te vinden en de samenhang hier tussen te bepalen. Vier NIRFP's (E2-Crimson, eqFP670, mNeptune en iRFP) werden geselecteerd op basis van hun fluorescerende eigenschappen. Vervolgens werden deze NIRFP's in vitro getest, om na te gaan of ze geschikt zijn voor fluorescentie beeldvorming, zonder combinatie met een ander fluorescerend eiwit. Ook werden er visualisatie-experimenten in levende cellen uitgevoerd met deze NIRFP's, waarbij eerst geverifieerd werd of deze geschikt zijn in éénkleur visualisatie en in een latere fase getest voor hun bruikbaarheid in tweekleuren visualisatie. Indien deze geschikt zijn voor tweekleuren visualisatie, zouden deze in combinatie met een ander fluorescerend eiwit, indien ze met elkaar verbonden zijn, op hetzelfde moment een fluctuatie signaal moeten geven. Uit deze verschillende experimenten kan besloten worden dat E2-Crimson, eqFP670 en iRFP wel degelijk tot de groep van bijna-infrarode fluorescente eiwitten behoren, terwijl mNeptune eerder tot de groep van rode fluorescente eiwitten behoort. Tevens werd er duidelijk aangetoond dat het mogelijk is om deze NIRFPs te gebruiken voor in vitro analyse met fluorescentie beeldvorming technieken. In cellen werd eveneens aangetoond dat deze NIRFP's gebruikt kunnen worden om de beweging van moleculen te bestuderen, maar dat ze op dit moment nog niet geschikt zijn om in combinatie met een ander fluorescerend eiwit gebruikt te worden om interacties in cellen aan te tonen. Globaal kan er dus besloten worden dat, hoewel de in deze thesis bestudeerde NIRFP's een aantal interessante spectrale eigenschappen bezitten en gebruikt kunnen worden voor éénkleuren fluctuatie analyse, er toch betere NIRFP's (maturatie, helderheid, etc) nodig zijn.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Translocations of the KMT2A gene are frequently observed in acute leukemias with particularly poor prognoses. Fusion of KMT2A with one of over 90 different partner genes establishes an oncogenic gene expression program via the expression of a chimeric protein. Despite the diversity of fusion partners, all retain the N-terminal region of KMT2A. Consequently, a common feature of all known KMT2A oncoproteins is the formation of a ternary complex, comprising MENIN and lens epithelium-derived growth factor p75 (LEDGF/p75), on the N-terminus. Various studies have demonstrated the importance of the KMT2A-MENIN-LEDGF/p75 ternary complex in KMT2A-r leukemogenesis. Herein, LEDGF/p75 serves as a molecular tether targeting the oncogenic fusion protein to the chromatin in a manner reminiscent to its role as a cellular cofactor in Human Immunodeficiency Virus type-1 (HIV-1) infection. Functionally, the N-terminal integrase binding domain (IBD) and C-terminal Pro-Trp-Trp-Pro (PWWP) domain of LEDGF/p75 are essential to facilitate these pathogenic processes. Aside from LEDGF/p75, hepatoma derived growth factor (HDGF)-related protein 2 (HRP2) is the only other protein to contain both an IBD and a PWWP domain. Unpublished results from our group have demonstrated the binding of HRP2 to the N-terminal fragment of KMT2A, suggesting a potential role in KMT2A-r leukemia. In line with a prior study showing impaired proliferation of KMT2A-transformed cells upon depletion of LEDGF/p75, a knockdown of HRP2 was examined. This revealed an impaired growth of cells upon depletion of HRP2. Interestingly, the role of HRP2 in cellular growth was seemingly independent of KMT2A-fusions, suggesting a more general pro-survival role. In this thesis, the effect of HRP2 knockdown on growth was evaluated in various leukemic and non-leukemic cell lines. The results confirmed a KMT2A-fusion independent effect on growth upon depletion of HRP2. Furthermore, in light of the COVID-19 pandemic, a role of LEDGF/p75 in facilitating nucleosome accessibility was examined using previously acquired AFM images. Whilst the analysis did not demonstrate an obvious role of LEDGF/p75, more data would have to be acquired to draw solid conclusion.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Single molecule Forster resonance energy transfer (smFRET) is a research methodology that has been on the rise for the past 10 years. At some point in a biochemical study it is useful to study the conformational dynamics of a particular protein system. By means of the energy transfer between 2 fluorophores, FRET can calculate the intramolecular immunity and thus quantify different states of a molecule. In Leuven, the smFRET confocal microscope is used for this purpose. The observation time of the molecule is limited to a maximum of 10 ms. However, many conformational dynamics in nature are slower than that and cannot be observed using this current technique. This limit can be exceeded by immobilizing the molecule for interest on a surface. This keeps the molecule in focus for longer and in the best case the molecule can be observed for up to 1 second, from which it is possible to quantify slower conformational dynamics. Dynamics can be studied in different ways, the most simple and therefore obvious way is to use a simple model system, DNA Hairpins. In the first part of the thesis, smFRET measurements were made on dynamic hairpins that differ in stem sequence and therefore exhibit a different thermodynamic stability. A rising salt concentration was implemented which modified the open/close kinetics of the hairpin molecule by a reduced repulsion of the intramolecular charge of the phosphodiester binding of DNA. The opening and closing rate of the different hairpins was calculated using DynamicPDA analysis and compared with each other. In the second part of the thesis a protocol was created to immobilize biotinylated molecules on a surface. Two different types of strategies were used: BSA and PLL-PEG. These two were compared on the basis of unspecific binding and density in preparation for the immobilization experiments using a TIRF microscope. In a second project we took part in a continuation of the Hellenkamp study. This is a multi-laboratory benchmark study in which 20 different research institutions participate.