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Le sévoflurane (fluoro-2,2,2-trifluoro-1-(trifluorométhyl)-éthylether) est un agent anesthésique relativement nouveau qui a tendance à remplacer l’halothane lors de brèves opérations chirurgicales (amygdalectomies...). Il est utilisé en circuit fermé ou ouvert, avec une exposition potentiellement significatives pour le staff médical (anesthésistes, chirurgiens infirmières...) dans le second cas. D’autre part, une exposition professionnelle pourrait engendrer des effets délétères sur la santé (bien qu’à notre connaissance aucune étude n’a démontré l’existence de tels effets). Le personnel professionnellement exposé au sévofluorane rapporte cependant des effets de type céphalée et fatigue ainsi que certaines modification neurocomportementales. Il est donc important de pouvoir recourir à un monitoring biologique d’exposition. Pour cela nous avons voulu évaluer l’utilité du dosage urinaire des deux métabolites du sévofluorane (fluor et HFIP).
L’étude a porté dur 50 sujets professionnellement exposés au sévofluorane dans les salles d’opérations de 9 hôpitaux (8 en Belgique et 1 en France). Pour évaluer l’exposition externe au sévofluorane, des échantillons d’air ont été collectées durant toute la période de travail par un badge passif (3M 3500 organic vapor monitor) attaché dans la zone respiratoire de chaque sujet. L’urine a été collectée avant et à la fin de chaque anesthésie pour la détermination de HFIP, fluor et créatinine. Le HFIP total dans l’urine a été déterminé par chromatographie en phase gazeuse (head space) (limite de détection 0.5 mg/l), tandis que le fluor et la créatinine ont été déterminés respectivement avec une électrode spécifique (limite de détection 0.1mg/l) et suivant la méthode de Jaffe.
Nous avons observé une relativement bonne corrélation entre l’exposition externe d’une part et la dose interne d’autre part estimée par la concentration en HFIP et en fluor dans les échantillons urinaires après exposition.
La détermination d’HFIP dans les échantillons urinaires après exposition semble dès lors être un marqueur prometteur pour évaluer l’exposition professionnelle au sévofluorane. Ce marqueur sera utile dans des études ultérieures pour déterminer la concentration maximale d’anesthésique (sévofluorane) à laquelle le staff médical pourra être exposé sans danger

Environmental Monitoring --- Anesthetics, Inhalation

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Pharmacovigilance --- Pharmacogenetics --- Pediatrics

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Background : The association of clopidogrel and acetylsalicylic acid is cornerstone of antiplatelet treatment but it’s well known that clopidogrel resistance occurs in some population. Different factors participate in the heterogeneity of clopidogrel response. In this work I will focus on the genetic aspect. Discussion: CYP2C19 gene is significantly associated to clopidogrel high on-treatment reactivity. Wild-type allele has normal activity, others have loof function activity but one of its has gain of function allele (*17, increase risk of severe bleefing).*2 allele is associated to poor clinical outcome in particular for percutaneous stent thrombosis. ABCB1 is not significantly associated with high on treatment reactivity but more studies are still necessary. P2Y12 receptor and the other cytochromes involved in clopidogrel activation are not associated with poor clinical outcome. Conclusion: According to the Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium it is important to genotype patients to evaluate the associate risk of the phenotype. For the poor metaboliser of CYP2C19 it’s recommended to take an alternative treatment like prasugrel if this one is not counter-indicated because of the associated risks Contexte : Le clopidogrel est avec l’acide acétylsalicylique un pilier du traitement antithrombotique mais il est connu pour avoir une “résistance” chez certains patients. En effet, la réponse au clopidogrel n’est pas homogène, différents facteurs participent à la résistance, celui qui est développé dans ce travail est l’aspect génétique. Discussion : Un gène est significativement associé à la résistance au clopidogrel, c’est le CYP2C19. Pour ce gène l’allèle wild-type fonctionne normalement, par contre les autres allèles ont une perte de fonction sauf un possédant un gain de fonction (*17, risque d’hémorragie accru). L’allèle *2 est associé à une diminution de l’activité thérapeutique du clopidogrel en particulier lors d’angioplastie percutanée avec pose d’un stent. ABCB1 n’est quant à lui pas significativement impliqué dans la baisse de l’effet mais des études supplémentaires sont nécessaires. Le récepteur P2Y12 et les autres cytochromes impliqués dans l’activation du clopidogrel ne sont pas significativement associés à une diminution de l’effet du traitement. Conclusion : Selon le Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium il est pertinent de génotyper les patients ne connaissant pas leur génotype pour évaluer le risque associé à leur phénotype. Pour les métaboliseurs lents du CYP2C19 il est recommandé de trouver une alternative au traitement comme par exemple passer au prasugrel s’il n’y pas de contre-indications de celui-ci

clopidogrel --- Platelet Aggregation inhibitors

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Vitamin K antagonists are medicines which are widely prescribed throughout the world. The effectiveness of these treatments is dependent on a delicate balance, which is influenced by many factors both specific to the patient and the environment: a low dose may be insufficient for therapeutic effectiveness, while a high dose may increase the risk of bleeding. A regular measurement of a biological parameter called International Normalized Ratio is required in order to provide a personalised adaptation of the dose. In order to optimise the anticoagulation, each patient treated by vitamin K antagonists has to reach a target value of this biological indicator. Since the anticoagulant response is influenced by many factors and varies from one patient to another, we propose to study the potential influence of the genetic constitution of each individual, as a basis of individual variations. Pharmacogenetics assesses the role played by genetic factors on the clinical response to drugs. In the case of vitamin K antagonists, the genes that influence the response to the drug are those involved in their metabolism and in the synthesis of the target on which they act. Many studies have been conducted in order to highlight the importance of these genes and their polymorphisms in the therapeutic effect of oral anticoagulants. These have demonstrated a clear relationship between some genetic polymorphisms and the anticoagulant effect of vitamin K antagonists. Dosage algorithms can help the practitioner to determine the initial dose to be prescribed. Unfortunately, these algorithms are only available for warfarin, which remains the most widely prescribed anticoagulant in the world. In Belgium, the use of acenocoumarol is more frequent compared to warfarin. However, genetic data in relation to warfarin are more abundant compared to acenocoumarol. We will analyse several clinical trials showing that both compounds have similar characteristics and suggesting the importance of pharmacogenetics for their clinical use Les antagonistes de la vitamine K sont des médicaments largement prescrits partout dans le monde. L’efficacité et la sécurité de ces traitements reposent sur un équilibre fragile, influencé par des facteurs environnementaux et des facteurs propres au patient: une dose trop faible est insuffisante pour obtenir une efficacité thérapeutique alors qu’une dose trop élevée peut augmenter les risques de saignements. Une adaptation strictement individuelle du traitement est nécessaire par mesures régulières d’un paramètre biologique appelé International Normalized Ratio. Pour chaque patient traité par antagonistes de la vitamine K on détermine une valeur cible de cet indicateur biologique pour obtenir un niveau anticoagulant optimal. Puisque la réponse anticoagulante est influencée par de nombreux facteurs et qu’elle est variable d’un patient à l’autre, pourquoi ne pas s’intéresser à la constitution génétique de chaque individu qui est une des bases de la variabilité individuelle? La pharmacogénétique s’engage à étudier l’influence des caractéristiques génétiques des patients sur la réponse clinique aux traitements médicamenteux. Dans le cas des antagonistes de la vitamine K, les gènes qui influencent la réponse aux médicaments sont ceux qui interviennent dans leur métabolisme et dans la synthèse de la cible sur laquelle ils agissent. De nombreuses études ont été menées dans le but de mettre en évidence l’importance de ces gènes dans la réponse aux anticoagulants oraux. Elles ont démontré une association claire entre certains gènes et la réponse anticoagulante aux antagonistes de la vitamine K. Des algorithmes de dosage peuvent aider le praticien à déterminer la dose initiale à administrer au patient. Malheureusement, ces algorithmes ne sont actuellement disponibles que pour la warfarine qui reste l’anticoagulant le plus prescrit dans le monde. En Belgique, l’utilisation de l’acénocoumarol est plus fréquente que celle de la warfarine. Cependant, les données génétiques concernant la warfarine sont plus abondantes. Nous analyserons plusieurs essais cliniques montrant que ces deux molécules ont des caractéristiques proches et l’importance de la pharmacogénétique dans ce type de traitement

Vitamin K --- International Normalized Ratio --- Pharmacogenetics --- Acenocoumoral --- Warfarin

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Les protéines d’efflux jouent un rôle important dans l’absorption, la distribution et l’excrétion de nombreux xénobiotiques, notamment les médicaments antirétroviraux et les immunosuppresseurs. Ces protéines sont dès lors susceptibles d’influencer la réponse thérapeutique à ces médicaments en affectant directement leur profil pharmacocinétique. Le but principal de ce mémoire était d’étudier l’activité de la protéine d’efflux ABCBI vis-à-vis de différents substrats et d’évaluer l’impact fonctionnel d’un polymorphisme génétique en particulier (ABCBI 1199G>A) sur cette activité. Nous avons analysé plus particulièrement l’influence de ce polymorphisme ABCB1 1199G>A sur l’accumulation intracellulaire et l’activité d’efflux d’ABCB1 vis-à-vis du Lopinavir (LPV), médicament antirétroviral, et vis-à-vis du Tacrolimus (Tac) et de la Ciclosporine (C5A), médicaments immunossuppresseurs. Ces études fonctionnelles ont été réalisées dans des modèles recombinants surexprimant soit la forme sauvage (1199G) soit la forme mutée (11 99A) d’ABCB1. Le premier objectif du mémoire consistait à achever la caractérisation du modèle cellulaire recombinant préalablement établi au sein du laboratoire de manière à valider de manière rigoureuse le modèle d’étude et de s’assurer ainsi de la pertinence de celui-ci pour nos études fonctionnelles. Ceci a été réalisé en confirmant, par une technique d’immunofluorescence, que seuls les clones recombinants transfectés avec le c-DNA ABCB1 sauvage ou muté surexpriment la protéine d’intérêt alors que les cellules HEK293 non-transfectées présentent une expression basale nulle ou du moins très faible. Nous avons également analysé l’activité de la protéine dans les clones recombinants en évaluant l’impact de cette surexpression sur l’accumulation intracellulaire d’un substrat fluorescent ‘d’ABCB1, la Rhodamine 123 (Rh123), en présence ou non de deux inhibiteurs d’ABCB1 (leVérapamil ou le Ritonavir). Les résultats obtenus montrent qu’en présence de Vérapamil ou de RTV, l’activité d’efflux d’ABCB1 semble inhibée dans les clones recombinants. En effet, nous avons observé une augmentation de l’intensité de fluorescence intracellulaire, liée à une accumulation accrue de Rh123, lorsque l’activité d’ABCB1 est inhibée au sein des clones recombinants alors que cette intensité fluorescente n’est que légèrement affectée par ces inhibiteurs dans les cellules non-transfectées. Aussi, nous avons constaté que, en absence d’inhibiteur, les cellules 1199A présentent une fluorescence intracellulaire légèrement inférieure comparées aux cellules 1199G. Notre hypothèse est la suivante; l’allèle 1199A serait lié à une légère hausse d’activité d’ABCB1 vis-à-vis de la Rh123. Combinés aux résultats préalablement obtenus par western blot et immunofluorescence, nous avons donc pu valider ce modèle cellulaire recombinant. Le second objectif consistait en l’étude de l’impact fonctionnel du polymorphisme ABCB1 1199G>A sur l’activité d’ABCB1 de manière à pouvoir confirmer in vitro des associations observées in vivo. En effet, il a été suggéré que le polymorphisme ABCB1 1199G>A affecte l’activité de cette protéine de manière substrat spécifique. Cette mutation a en effet été liée à une diminution de l’activité d’ABCB1 vis-à-vis du Tac, alors que ce variant allélique a été associé à une augmentation de l’activité d’ABCB1 vis-à-vis de la CsA. Nous avons par ailleurs testé si ce polymorphisme influençait la perméabilité cellulaire du LPV, comme démontré in vitro par Woodahl et son équipe. Nous avons pu confirmer que le variant allélique 1199A est bien associé à une activité d’efflux moins importante vis-à-vis du Tac et dès lors, à une accumulation intracellulaire accrue du médicament. En ce qui concerne la CsA, nous avons confirmé l’effet opposé; c’est-à-dire que la protéine mutée possède une activité d’efflux plus importante vis-à-vis de la CsA que la protéine sauvage. Dès lors, ceci semble indiquer que ce polymorphisme ABCB1 1199G>A a bien un impact fonctionnel sur l’activité de la protéine qui dépend du substrat investigué et par conséquent, influence l’accumulation intracellulaire de ses substrats. En accord avec l’hypothèse selon laquelle la nature de l’effet de ce polymorphisme est substrat spécifique, nous avons pu observer que cette mutation n’influence pas l’accumulation intracellulaire et l’activité d’efflux d’ABCB1 vis-à-vis du LPV. En conclusion, les résultats obtenus permettent donc de confirmer l’hypothèse selon laquelle le polymorphisme ABCB1 1199G>A aurait un impact différent selon le substrat investigué et affecterait l’activité et l’affinité de la protéine pour ses substrats.

ABCB1 protein, human --- Cyclosporine --- Tacrolimus --- Multidrug Resistance-Associated Proteins