Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Serum amyloïd A (SAA) is een eiwit dat behoort tot de acute fase eiwitten. Dit eiwit wordt gebruikt als merker om verschillende ziektes op te volgen. De SAA eiwitten worden aangemaakt in de lever. Er bestaan vier verschillende genen die coderen voor SAA. SAA1 (met subtype SAA1α, SAA1ꞵ en SAA1γ) en SAA2 (met subtype SAA2α en SAA2ꞵ) worden samen ook de ‘acute fase SAA’s’ (A-SAA) genoemd. Tijdens de acute fase respons kan de concentratie van de A-SAA’s 100- tot 1000-maal in het serum stijgen. De oorzaken van deze sterke stijging zijn van uiteenlopende aard, gaande van een breuk, infectie, kanker tot inflammatoire reacties. Het SAA3 eiwit verschilt sterk van SAA1 en SAA2. Het wordt niet door de lever geproduceerd en in een lage concentratie teruggevonden in de epitheelcellen van de melkklieren. Ten slotte is er het SAA4 eiwit waarvan de serumconcentraties vrijwel altijd constant blijven, vandaar dat dit eiwit ook ‘constitutief SAA’ (C-SAA) wordt genoemd. Tijdens de evolutie is de nucleotide- en aminozuursequentie van het SAA eiwit sterk geconserveerd gebleven. Dit suggereert dat de SAA eiwitten een essentiële rol in het menselijk lichaam spelen. Ondanks het uitgebreide onderzoek op deze eiwitten, zijn nog niet al hun functies ontrafeld. De belangrijkste pro-inflammatoire eigenschap die aan de SAA’s is toegewezen, is de aantrekking van leukocyten. Het onderwerp van deze masterthesis is de optimalisatie van de recombinante expressie van het humaan acute fase eiwit SAA2ꞵ. De correcte nucleotidesequentie van dit gen werd in het pET3a plasmide gekloneerd. Vervolgens werd het SAA2ꞵ-pET3a plasmide getransformeerd naar de One shot BL21 (DE3) pLysS Escherichia coli (E. coli) cellen. Deze cellen hebben de voorkeur om een grote hoeveelheid recombinante eiwitten te produceren, die toxisch kunnen zijn in de gewenste concentraties. Met het oog op een maximale expressie van SAA2ꞵ werden verschillende parameters bestudeerd die een invloed hebben in het productieproces. De resultaten geven aan dat bij een incubatietemperatuur van 30 °C de hoogste opbrengst bekomen wordt in vergelijking met 25 °C en 35 °C. Ook de concentratie van de inducer isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) werd reeds uitgetest waarbij de hoogste concentratie van SAA2ꞵ geproduceerd werd bij een concentratie van 0,5 mM IPTG in vergelijking met 1 mM en 2 mM. In de toekomst kunnen concentraties tot een minimum van 0,1 mM verder uitgetest worden. Uit eerdere onderzoeken is gebleken dat andere parameters zoals de pH, de aanwezigheid van voldoende zuurstof en de tijd van incubatie een invloed hebben op het productieproces. Deze invloeden worden theoretisch besproken in de discussie van deze thesis. De geproduceerde hoeveelheid SAA2ꞵ werd gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van sandwich-ELISA’s en SDS-PAGE gevolgd door Western blots. Om het SAA2ꞵ eiwit vervolgens te zuiveren, werd er gebruik gemaakt van kationenuitwisselingschromatografie. De invloed van de pH van de uitgeteste equilibratiebuffers werd nagegaan en er kan besloten worden dat het eiwit stabiel is in een zure omgeving tot pH 4. Toch werd SAA2ꞵ niet geëlueerd van de kolom met behulp van de uitgeteste elutiebuffer. Deze zuiveringstechniek moet in de toekomst verder op punt gezet worden om zuiver SAA2ꞵ te bekomen. Het gezuiverde SAA2ꞵ kan gebruikt worden om de biologische activiteit verder te onderzoeken. Specifiek kan de activiteit op leukocyten bestudeerd worden en dit in vergelijking met het humaan SAA1.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Steekmuggen maken deel uit van de invertebrata en arthropoda. Leden van de familie Culicidae behoren tot de meest voorkomende overdragers van verschillende parasitaire en virale infecties. Binnen deze familie zijn 3.500 muggensoorten gekend, waarvan 300 in staat zijn pathogene virussen te verspreiden onder vertebraten, zoals de mens. Daarom worden ze arbovirussen genoemd, acroniem voor arthropod-borne viruses. Arbovirussen vormen een bedreiging voor de publieke gezondheid en bijgevolg is het van belang deze in kaart te brengen. De meeste arbovirussen behoren tot vier families, waaronder de Flaviviridae familie. Tot deze familie behoort het geslacht Flavivirus, de meest frequente virussen wereldwijd. Vervolgens wordt in dit geslacht de Japanse encefalitis virus groep waargenomen, een groep pathogene virussen met de grootste distributie wereldwijd, die enkel door muggen wordt overgedragen. Deze bevat het West Nile virus, Usutu virus, Saint Louis Encephalitis virus, en Japanse encefalitis virus. Wanneer het menselijk lichaam geïnfecteerd is, ondervindt circa 20% na gemiddeld twee tot veertien dagen symptomen zoals hoofdpijn, koorts en vermoeidheid. Daarbij is aangetoond dat bij 1% van de patiënten de infectie kan evolueren tot een hersen- of hersenvliesontsteking. De vrouwtjes van 105 muggensoorten van het geslacht Culex zijn in staat arbovirussen te verspreiden. Vooral Culex pipiens is een veelvoorkomende soort die als virale transmitter dient. Vrouwelijke muggen hebben na het paren proteïnen nodig om eitjes te produceren. Deze proteïnen halen ze uit bloed van onder andere mensen, paarden, en vogels. Geïnfecteerde mensen en paarden zijn dead-end gastheren aangezien virussen niet in voldoende mate repliceren om verdere transmissie te veroorzaken. Daarnaast zijn vogels een geprefereerd doelwit voor een bloedafname, maar ook voor de replicatie van arbovirussen. Wanneer een steekmug bloed zuigt van een geïnfecteerde vogel, moeten vier barrières overwonnen worden vooraleer de mug via zijn speeksel het virus naar een nieuwe prooi overbrengt. Deze vier barrières worden midgut infection, midgut escape, salivary gland infection, en salivary gland escape genoemd. Niet alleen kan elke barrière het virus elimineren, ook micro-organismen in het microbioom kunnen de overdracht van arbovirussen beïnvloeden. Wolbachia, Culex Flavivirus, en Nhumirim virus zijn een groep bacteriën en twee insect-specifieke virussen die deel uitmaken van het bacterioom en viroom. De invloed van deze micro-organismen op de overdracht van West Nile virus werd reeds aangetoond. Daarnaast veroorzaakt de cellulaire en humorale aangeboren immuunrespons een antivirale werking in Culex muggen. Culex pipiens is niet alleen één van de belangrijkste soorten die arbovirussen transmitteren, daarnaast is het ook de soort die in België het meeste voorkomt. Het viroom van gecollecteerde muggen kan onderzocht worden, waarna een analyse van de insect-specifieke virussen, bacteriën en hun effect op de verspreiding van arbovirussen mogelijk is. Dit onderzoek gebeurt aan de hand van het NetoVIR protocol, gebaseerd op het opzuiveren van virale partikels uit biologische stalen, in combinatie met Illumina Next Generation Sequencing, opgesteld in het Rega Instituut. Vervolgens worden bio-informatische analyses toegepast om resultaten te bekomen over de aanwezige virussen en deze te kunnen vergelijken. Verder onderzoek op Culex muggen in België is noodzakelijk om een conclusie te kunnen vormen.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Chemokines spelen een cruciale rol in de regeling van leukocytencirculatie in homeostatische en inflammatoire condities. Eén van de meest bestudeerde chemokines is CXCL8, het meest potente chemokine dat chemotaxis van neutrofiele granulocyten naar de plaats van inflammatie induceert bij de mens. CXCL8 kan posttranslationele modificaties ondergaan waardoor er verschillende natuurlijk voorkomende vormen ontstaan. Bij de huidige opsporingsmethode van CXCL8 kan er geen onderscheid worden gemaakt tussen deze verschillende CXCL8-vormen. Het maken van dit onderscheid is echter van belang aangezien er een significant verschil is tussen de biologische activiteit van de verschillende CXCL8-vormen. In deze thesis werd nagegaan of het mogelijk is om CXCL8-vormen te identificeren en te kwantificeren met behulp van nano-LC in combinatie met tandem-massaspectrometrie (MSMS). Hiervoor werden vier verschillende vormen, CXCL8(6-77), CXCL8(7-77), CXCL8(8-77) en CXCL8(9-77) aangemaakt via chemische peptidesynthese. zuivering en detectie van de gesynthetiseerde vormen gebeurde aan de hand van RP-HPLC en massaspectrometrie. De hoeveelheid CXCL8(6-77), CXCL8(7-77), CXCL8(8-77) en CXCL8(9-77) die werd geproduceerd bedroeg respectievelijk 40,7; 12,6; 58,9 en 103,5 μg. Bij het uitvoeren van de nano-LC met MSMS voor de vorm CXCL8(9-77) werd het negenvoudig geladen moederion ([900,43]9+) geselecteerd voor fragmentatie. Er bleek een dosis-responsverband te bestaan tussen de hoeveelheid CXCL8(9-77) en de intensiteit van de twee meest abundant gevormde fragmentionen ([1128,4]5+ en [615,3]4+) als gebruik gemaakt werd van een lage fragmentatie-energie. Aangezien een plasmastaal veel moleculen zoals vetten en eiwitten bevat die de kolom van de nano-LC zouden verstoppen is het nodig om de CXCL8-vormen eerst gedeeltelijk uit het plasma te zuiveren. In een tweede deel van de thesis werd nagegaan of het mogelijk was een pre-zuivering uit te voeren met behulp van CXCL8-antistoffen gecoat op “beads” in een minikolom. In dit geval werd het CXCL8-rendement bepaald na toevoeging van plasma met een gekende hoeveelheid CXCL8 aan de minikolom. Tijdens optimalisatie werd het beste rendement behaald door gebruik te maken van een was- en elutiebuffer met aminozuren en een detergent, de elutiebuffer had een pH van 2,8 en de fracties werden na elutie geneutraliseerd tot pH 7. Het rendement van de elutie in vergelijking met de hoeveelheid toegevoegde CXCL8 en de elutie in vergelijking met het inputstaal bedroeg respectievelijk 16,5 % en 38 %.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Deze thesis is toegespitst op specifieke moleculen die de communicatie tussen de talrijke onderdelen van het immuunsysteem regelen, namelijk de cytokines en meer specifiek een subfamilie ervan, de chemokines. Cytokines zijn kleine proteïnen die worden geproduceerd door vrijwel alle types immuuncellen en zijn betrokken bij zowat alle facetten van het immuunsysteem zoals antigenpresentatie, beenmergcel differentiatie en activatie/expressie van adhesiemoleculen. Een subfamilie ervan, de chemokines, zijn kleine structureel verwante cytokines en hebben als belangrijkste taak de migratie van andere immuuncellen naar plaatsen waar deze nodig zijn verzorgen en dit doen ze volgens de principes van ‘chemotaxis’ en ‘leukocytextravasatie’. Hiervoor binden chemokines op hun overeenkomstige receptoren op doelwitcellen en induceren daarmee de activatie van cytoskelet-proteïnes en de expressie en activatie van celoppervlak adhesiemoleculen, waardoor de doelwitcellen kunnen migreren doorheen het weefsel. Het experimentele deel van deze thesis bestaat voornamelijk uit 3 delen: In het 1e experiment wordt de chemotactische activiteit van 2 verschillende vormen van het chemokine CCL23, namelijk sCKβ8 en sCKβ8-1, op neutrofielen bestudeerd. Volgens de literatuur zou de langere sCKβ8-1 vorm een hogere chemotactische activiteit moeten vertonen op neutrofielen dan de sCKβ8 vorm omdat hij zowel op CCR1 als op formyl peptide receptor 2 (FPR2) bindt terwijl sCKβ8 enkel op CCR1 bindt. Dit wordt ook bevestigd door de resultaten van mijn experimenten. In het 2e experiment wordt nagegaan of deze vormen in combinatie met CXCL8 synergie vertonen in migratie van neutrofielen. Synergie is een samenwerking tussen verschillende cytokines waardoor ze samen een sterkere activiteit vertonen dan hun additionele activiteiten. Uit mijn experiment blijkt er zich echter geen synergie voor te doen tussen de CCL23 vormen en CXCL8 voor het aantrekken van neutrofielen. In het 3e experiment wordt onderzocht of ‘perifeer bloed mononucleaire cellen’ (PBMC’s) m.b.v. bepaalde stimuli geïnduceerd kunnen worden tot de productie van de chemokines MCP-1 (CCL2) of MIP1-α (CCL3). Hier lijken ook beide CCL23 vormen geen MCP-1 of MIP1- productie te induceren, maar te weinig experimenten bekwamen hier bruikbare resultaten dus deze conclusie kunnen we niet statistisch bevestigen.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

The acute phase response is a sequence of events that takes place in order to re-establish homeostasis when the human body is challenged by an inflammatory stimulus. One such event is the upregulated production of certain proteins in the liver, known as positive acute phase proteins. In humans, serum amyloid A (SAA) is one of the two major acute phase proteins whose serum concentration can increase up to 1000-fold during an APR. This highly conserved protein family comprises of four different variants of which only SAA1 and SAA2 are inducible by an inflammatory stimulus. Most of the research on the biological activity of SAA1 has been performed using a commercially available variant of SAA1 that is recombinantly expressed in E.coli. Recently, it was shown that most of the inflammatory, Toll-like receptor (TLR)-mediated, properties attributed to SAA1 are actually due to contamination of recombinantly expressed forms with bacterial lipopolysaccharides and lipoproteins. More recent studies, using a purified version of the recombinant SAA1, have confirmed its formyl peptide receptor-mediated functions. SAA1 has been shown to undergo post-translational modification by multiple proteases, thereby generating SAA1-derived peptides. The aim of this project was to address the lack of research on the biological activity of these peptides by performing multiple biological assays on both neutrophils and CD14+ monocytes. For this purpose, commercially available recombinant SAA1 was purified to homogeneity and a number of SAA1-derived peptides were chemically synthesized. Neutrophils, stimulated with a variety of inducers, were incubated with intact SAA1 or one of its derived peptides. In this way, their effect on CXCL8 expression, degranulation and mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production were determined. Unstimulated neutrophils treated with SAA1 (98-104) produced significantly less CXCL8 compared to the control. A similar, albeit non-significant, effect was observed for the SAA1 (92-104) peptide, indicating a possible effect of COOH-terminal SAA1 peptides on basal CXCL8 expression in neutrophils. Furthermore, intact SAA1 consistently downregulated CXCL8 production across all different conditions, further substantiating the hypothesis that SAA1 is not only an inflammatory mediator but also an anti-inflammatory one. The COOH-terminal fragments SAA1 (92-104) and SAA1 (98-104) were shown to upregulate spontaneous neutrophil degranulation. Intact SAA1 inhibited degranulation and CXCL8 expression in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated neutrophils, reinforcing the theory that SAA1 binds directly to LPS and thereby disrupts the interaction between LPS and TLR4. IL-1-stimulated neutrophils released significantly less MPO when treated with SAA1 (92-104), an effect that was not observed when they were incubated with intact SAA1. Additionally, preliminary data suggests that SAA1 (70-104) increases mitochondrial ROS production in human neutrophils. Taken together, these findings show that certain SAA1-derived peptides have an effect on the biological function of neutrophils, possibly in ways distinct from the intact SAA1 protein.