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The insulin-secreting pancreatic B-cell is electrically excitable. Glucose induces insulin secretion by depolarising the plasma membrane. This opens the voltage-dependant calcium channels and increase the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c) which triggers exocytosis. The role of the endoplasmic reticulum (ER) in the glucose-induced [Ca2+]c rise is disputed. Moreover, the role of Ca2+-binding proteins, like calbindin, is largely unknown in B-cells. The aim of this work was therefore double:
Role of the endoplasmic reticulum:
In various cell types, Ca2+ can be released from the ER by three different mechanisms : IP3-Induced Ca2+ Release (IP3ICR) par IP3 receptors, Depolarization-Induced Ca2+ Release » (DIRC) by type 1 ryanodine receptors, and Ca2+-Induced Ca2+ Release (CICR) by the type 2, and, probably also, type 3 ryanodine receptors. We tested whether, in mouse B-cells, one or several of these mechanisms amplify the [Ca2+]c rise induced by Ca2+ influx through voltage-dependant Ca2+ channels.
When the plasma membrane in single B-cells is depolarised by high K+, [Ca2+]c increases to a large extent and, in some cells, the rise in [Ca2+]c is biphasic and characterized by a second phase occurring soon after [Ca2+]c levels up. No second phase is observed in cells pretreated with thapsigargin, a potent inhibitor of the ER in the [Ca2+]c rise elicited by a depolarization. To test the existence of a DIRC is well established. To look for the existence of a CICR in B-cells, we used physiological (depolarization by high K+) and pharmacological (caffeine that activates ryanodine receptors) approaches. In a Ca2+-free medium, depolarization and caffeine have no effect on B-cell [Ca2+]c, but increase [Ca2+]c in skeletal muscle fibers, a preparation where DICR is well established. To look for the existence of a CICR in B-cells, physiological (short depolarizations in the presence of extracellular Ca2+ using the patch-clamp technique) and pharmacological (caffeine) approaches were again used. The existence of CICR can be disclosed in patch-clamp experiments by a supralinear relationship between changes in [Ca2+]c and voltage-dependant Ca2+ currents. However, in B-cells, this relationship was infralinear, even in the presence of the CICR sensitizer, caffeine, that increases [Ca2+]c in cardiomyocytes, a preparation where CICR is well established. The second phase in the high K+-induced [Ca2+]c rise observed in some cells was resistant to high concentrations of ryanodine that inhibit ryanodine receptors and block DICR and CICR in skeletal fibers and cardiomyocytes. We also studied by RT-PCR the expression of the three ryanodine receptor isoforms. In B-cells, we detected only low mRNA levels if type 3 ryanodine receptors only, whereas in skeletal fibers and cardiomyocytes we detected large mRNA levels of the type 1 and 2 ryanodine receptor, the physiological role if which is largely unknown, DICR and CICR mechanisms are not involved in the [Ca2+]c rise elicited by a depolarization in B-cells.
IP3 receptors do not amplify the [Ca2+]c rise induced by Ca2+ influx through voltage-operated Ca2+ channels. Indeed, inhibition of IP3 receptors by microinjection of heparin in B-cells does not affect the [Ca2+]c rise induced by high K+.
Role of calbindin
Some recent studies pretend that, in B-cells, calbindin, a cytosolic Ca2+-binding protein, plays a role in high K+-induced [Ca2+]c rise and insulin secretion. In the present study, no difference in glucose- or high K+-induced [Ca2+]c changes was observed between calbindin knock-out (KO) and control mice. Glucose homeostasis of KO mice was normal, but fasting glycemia was lower in KO than in control animals. Immunodetections showed that calbindin is located only at the periphery of the islets, in glucagon and somatostatin-secreting cells. These results suggest that, contrary to what has recently been suggested, calbindin does not play any role in B-cells. However, it could modulate the function of glucagon and somatostatin-secreting cells La cellule B pancréatique sécrétant l’insuline est électriquement excitable. Le glucose stimule la sécrétion d’insuline en dépolarisant la membrane plasmique, ce qui ouvre les canaux calciques voltage-dépendants et augmente la concentration cytoplasmique de Ca2+ ([Ca2+]c) qui déclenche l’exocytose. Le rôle du réticulum endoplasmique (RE) dans l’élévation de la [Ca2+]c induite par le glucose est fortement controversé. De plus, le rôle des protéines liant le Ca2+, telle que la calbindine, est tout à fait méconnu dans le cellule B. le but de ce mémoire a donc été double :
Rôle du réticulum endoplasmique :
Dans de nombreux types cellulaires, le Ca2+ peut être relargué du réticulum par trois mécanismes différents : 1’ « IP3-Induced Ca2+ Release » (IP3ICR) par les récepteurs à l’IP3, le « Depolarization-Induced Ca2+ Release » (DIRC) par les récepteurs à la ryanodine de type 1 et le « Ca2+-Induced Ca2+ Release » (CICR) par les récepteurs à la ryanodine de type 2 et vraisemblablement 3. Nous avons testé si, dans les cellules B de souris, un ou plusieurs de ces mécanismes amplifient l’élévation de la [Ca2+]c induite par un influx de Ca2+ à travers les canaux calciques voltage-dépendants.
Lorsque la membrane de cellules B isolées est dépolarisée par une concentration élevée de K+ extracellulaire, la [Ca2+]c augmente fortement et, dans certaines cellules, l’élévation de la [Ca2+]c est caractérisée par une seconde phase qui se surajoute à la première. Aucune seconde phase n’est observée dans des cellules prétraitées à la thapsigargine, un puissant inhibiteur de la Ca2+-ATPase du RE qui vide le RE de son contenu en Ca2+. Cette observation suggère un rôle possible du RE dans l’élévation de la [Ca2+]c en réponse à une dépolarisation. Pour tester l’existence d’un DICR dans la cellule B, nous avons utilisé des approches physiologique (le dépolarisation par du K+ élevé) et pharmacologique (la caféine, qui active les récepteurs à la ryanodine). En l’absence de Ca2+ extracellulaire, la dépolarisation et la caféine sont sans effet sur la [Ca2+]c dans le cellule B, mais augmentent la [Ca2+]c dans les cellules musculaires squelettiques où le DICR est bien établi. Afin de déceler un CICR, des approches physiologiques (de courtes dépolarisations en présence de Ca2+ extracellulaire en utilisant la technique du patch-clamp) et pharmacologique (la caféine) ont à nouveau été utilisées. L’existence d’un CICR devrait se manifester par une relation supralinéaire entre les changements de la [Ca2+]c et le courants calciques voltage-dépendants. Or, dans la cellule B, la relation est plutôt infralinéaire, même en présence de caféine. La caféine augmente pourtant la [Ca2+]c dans les cellules cardiaques où le CICR joue un rôle important. La deuxième phase de l’élévation de la [Ca2+]c observée dans certaines cellules lors de la dépolarisation par du K+élevé n’est pas abolie par un prétraitement avec une forte concentration de ryanodine qui inhibe les récepteurs à la ryanodine et vloque le DICR et le CICR des cellules musculaires squelettiques et cardiaques. Pour compléter ces données fonctionnelles, nous avons étudié, par RT-PCR, l’expression des trois isoformes du récepteur à la ryanodine. Nous n’avons détecté que de faibles quantités d’ARNm pour le récepteur à la ryanodine de type 3 dans les cellules B, alors que nous détections des taux élevés d’ARNm pour les récepteurs à la ryanodine de type 1 et 2 pour les cellules musculaires squelettiques et cardiaques, respectivement. L’ensemble de ces résultats suggère que, malgré la présence de récepteurs à la ryanodine de type 3 dont le rôle physiologique est méconnu, les phénomènes de DICR et de CICR n’interviennent pas dans l’élévation de la [Ca2+]c induite par une dépolarisation dans la cellule B.
de même, les récepteurs, à l’IP3 n’amplifient pas l’élévation de la [Ca2+]c induite par un influx de Ca2+ à travers les canaux calciques voltage-dépendants. En effet, l’inhibition des récepteurs à l’IP3 par microinjection d’héparine dans les cellules B n’altère pas l’élévation de la [Ca2+]c induite par du K+ élevé.
Rôle de la calbindine
Selon certaines études, la calbindine, une protéine cytosolique liant la Ca2+, jouerait un rôle dans l’élévation de la [Ca2+]c dans la cellule B et dans la sécrétion d’insuline. Dans ce travail, aucune différence importante n’a été observée dans la [Ca2+]c en réponse à une dépolarisation ou au glucose entre des souris knock-out (KO) pour la calbindine et des souris contrôles. L’homéostasie glucidique des souris KO ne semble pas non plus affectée, mais la glycémie à jeun est inférieure chez les souris KO que chez les contrôles. Des immunodétections ont montré que la calbindine est localisée uniquement en périphérie de l’îlot, dans les cellules à glucagon et à somatostatine. Ces résultats suggèrent que, contrairement à ce qui a été rapporté dans la littérature, la calbindine ne jouerait aucun rôle dans la cellule B. Toutefois, elle pourrait peut-être moduler la fonction des cellules à glucagon et à somatostatine

Endoplasmic Reticulum --- Cytosol --- Pancreas

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Background and Objectives: Glucagon secreted by the u-cells of the islets of Langerhans is the major hyperglycemic hormone of the body. Its secretion is inhibited by glucose (G) by still unknown mechanisms. Sorne hypotheses suggest a direct effect of G on u-cells involving a decrease of the cytosolic Ca2 concentration ([Ca2+]c), and thereby of exocytosis. One possible mechanism responsible for this low [Ca2+]c might involve a closure of ATP-sensitive K+ channels (KATP channels). An indirect effect of G is also considered and would involve an inhibitory paracrine factor that would be released from cells close to u-cells, such insulin-secreting cells (p-cells) or somatostatin-secreting cells (8- cells), and that would indirectly inhibit glucagon release. The aim of my master thesis was to study the mechanisms by which G control glucagon secretion, and in particular ( 1) the rote of somatostatin in the glucagonostatic effect of G, (2) the rote of KATP channels in the control of glucagon secretion and in the glucagonostatic effect of G, (3) the existence of a direct mechanism of action of G on u-cells, and (4) the possible implication of a paracrine factor released from P-cells in the glucagonostatic effect of G. Material and Methods: Mouse islets were isolated by collagenase digestion of the pancreas and cultured ovemight in RPMI1640 medium containing 7 mM of G. For some experiments, the islets were dispersed into single cells, and then encapsulated or placed on cover-slips. Glucagon secretion was evaluated in incubation or perifusion experiments. Glucagon concentration was measured by radioimmunoassay. Results: (1) Firstly, evaluated the role of somatostatin in the glucagonostatic effect of G. To this end, compared the glucagon secretion in response to different concentrations of G between control islets and islets devoid of somatostatin paracrine influence (islets pretreated with pertussis toxin or isolated from somatostatin knockout mice). G inhibited glucagon secretion of control islets in a dose­ dependent manner (from 0 to 30 mM), with a maximal effect obtained already at around 7 mM. In the absence of somatostatin paracrine influence, G also inhibited , but less strongly, glucagon secretion. Again, the inhibition was maximal at around 7 mM G, but unlike the situation of control islets, its amplitude decreased for G concentrations > 7 mM. These results suggest that somatostatin is partially involved in the glucagonostatic effect of G, especially at G concentrations > 7 mM. (2) Secondly, 1 studied the role of KATP channels in the control of glucagon secretion. In control islets, KATP channel inhibition by tolbutamide reproduced the glucagonostatic effect of G. However, in islets lacking somatostatin paracrine influence, tolbutamide stimulated glucagon secretion. Therefore, it does not reproduce the glucagonostatic effect of glucose. These results suggest that (a) G and tolbutamide exert distinct effects, (b) the glucagonostatic effect of tolbutamide observed in control islets results from an inhibition of glucagon secretion by somatostatin secreted in response to tolbutamide, and (c) the direct effect of tolbutamide on u-cells is to stimulate glucagon release. Some authors have suggested that tolbutamide directly active Epac2 and that this effect can stimulate exocytosis by a mechanism in additional to that caused by the closure of KATP channels. Our experiments suggest that, in islet devoid of somatostatin paracrine influence, Epac2 activation is not involved in the glucagonotropic effect of tolbutamide since gliclazide, another KATP channel inhibitor without any effect on Epac2, also stimulated glucagon secretion. (3) Thirdly, to test de direct effect of G, 1 started developing the technique of measurement of glucagon secretion from dispersed u-cells. To perform perifusion experiments on these cells, we thought to encapsulate them in a polymerof alginate.Unfortunately, our results suggest that encapsulation compromises the secretion of the dispersed islet cells. We therefore resorted to the technique of glucagon secretion measurements from dispersed islet cells attached to cover-slips. ln these conditions, G stimulated insulin secretion and inhibited glucagon secretion but much Jess effectively than from whole islets. The technique should next be applied to FACS-purified u-cells. (4) Finally, to study the influence of paracrine factors released from P-cells on glucagon secretion, 1 used 2 models of P-cell death induction: the treatment of islet cells with streptozotocin, an agent supposed to specifically kill P-cells, or the use of transgenic mice (RIPrtTA­ tetDTA) in which P-cell death can be ihduced by doxycycline administration . The first mode) proved to be inadequate since streptozotocin became toxic to u-cells when used at concentrations which completely killed P-cells. By contrast, the RiprtTA-tetDTA model seemed to work properly because doxycycline administration induced diabetes. However, had not had time to evaluate the effect of this treatment on glucagon release. Le glucagon, sécrété par les cellules a des îlots de Langerhans est la principale hormone hyperglycémiante de l'organisme. Sa sécrétion est inhibée par le glucose (G) via desmécanismes toujours méconnus. Certaines hypothèses suggèrent un effet direct du G sur la cellule a impliquant une baisse de la concentration cytosolique de Ca2+ ([Ca2+]c) et, dès lors, de !'exocytose. Un des mécanismes responsables de cette baisse de [Ca2+lc impliquerait la fermeture des canaux K+ sensibles à l'ATP (canaux KATP). Un effet indirect du G est également envisagé et impliquerait un facteur paracrine inhibiteur qui serait libéré par des cellules voisines des cellules a telles que les cellules à insuline (cellules P) ou à somatostatine (cellules o) et qui inhiberait la sécrétion de glucagon. L'objectif de mon mémoire a été d'étudier les mécanismes par lesquels le G contrôle la sécrétion de glucagon, et en particu lier, (1) le rôle de la somatostatine dans l'effet glucagonostatique du G, (2) le rôle des canaux KATP dans le contrôle de la sécrétion de glucagon et dans l'effet glucagonostatique du G, (3) l'existence d'un mécanisme d'action direct du G sur les cellules a et (4) l'implication possible d'un facteur paracrine issu des cellules p dans l'effet glucagonostatique du G.Matériel et méthodes : Des îlots de souris ont été isolés par digestion à la collagénase du pancréas et cultivés pendant une nuit dans du milieu RPMI I640 contenant 7 mM de G. Pour certaines expériences, les îlots ont été dispersés en cellules isolées, puis encapsulées ou mises sur couvre-objet. La sécrétion de glucagon a été évaluée en périfusion ou incubation. La concentration de glucagon a été mesurée par dosage compétitif radio-immunologique ("radioimmunoassay" ou RIA).Résultats : (1) Dans un premier temps, j 'ai évalué le rôle de la somatostatine dans l'effet glucagonostatique du G. A cette fin, j'ai comparé la sécrétion de glucagon en réponse à différentes concentrations du G à partir d'îlots contrôle ou dépourvus d'influence paracrine de la somatostatine (îlots prétraités à la toxine pertussique ou isolés à partir de souris KO pour la somatostatine). Le G inhibe de façon dose-dépendante (de 0 à 30 mM) la sécrétion de glucagon d'îlots contrôle avec un effet maximal obtenu déjà à environ 7 mM. En l 'absence d'influence paracrine de la somatostatine, le G inhibe aussi, mais moins puissamment, la sécrétion de glucagon. L'inhibition est à nouveau maximale vers 7 mM de G, mais contrairement aux îlots contrôle, elle diminue en amplitude aux concentrations de G > 7 mM. Ces résultats suggèrent que la somatostatine est partiellement impliquée dans l'effet glucagonostatique du G surtout aux concentrations de G > 7 mM. (2) Dans un second temps, je me suis intéressée au rôle tenu par les canaux KATP dans le contrôle de la sécrétion de glucagon. Dans des îlots contrôle, l'inhibition des canaux KATP par le tolbutamide reproduit l'effet glucagonostatique du G. Toutefois, dans des îlots dépourvus d'influence paracrine de la somatostatine, le tolbutamide stimule la sécrétion de glucagon. Il ne reproduit dès lors pas l'effet glucagonostatique du G. Ces résultats suggèrent que (a) le G et le tolbutamide exercent des effets distincts, (b) l'effet glucagonostatique du tolbutamide observé dans des îlots contrôle résulte d'une inhibition de la sécrétion de glucagon par la somatostatine sécrétée en réponse au tolbutamide et (c) l'effet direct du tolbutamide sur la cellule a est de stimuler la sécrétion de glucagon. Certains auteurs ont suggéré que le tolbutamide active directement Epac2 et que cet effet puisse stimuler l'exocytose par un mécanisme supplémentaire à celui causé par la fermeture des canaux K ATP· Nos expériences suggèrent que, dans des ilots dépourvus d'influence paracrine de la somatostatine, l'activation de Epac2 n'est pas impliquée dans l'effet glucagonotrope du tolbutamide car le gliclazide, un autre inhibiteur des canaux KATP dépourvu d'effet sur Epac2, stimule également la sécrétion de glucagon . (3) Troisièmement, afin de tester l'effet direct du G, j'ai commencé à mettre au point la technique de mesure de sécrétion de glucagon à partir de cellules a dispersées. Pour pouvoir réaliser des expériences de périfusion sur ces cellules, nous avons pensé à les encapsuler dans un polymère d'alginate. Malheureusement, nos résultats suggèrent que l'encapsulation compromet la sécrétion des cellules dispersées. Nous avons donc eu recours à la technique de mesure de sécrétion à partir de cellules d'îlots dispersées et attachées sur couvre-objet. Dans ces conditions, le G stimule la sécrétion d'insuline et inhibe celle de glucagon mais de façon beaucoup moins efficace qu'à partir d'îlots. La technique devra encore être appliquée aux cellules a purifiées par FACS. (4) Enfin, pour étudier l'influence de facteurs paracrines issus de cellules p sur la sécrétion de glucagon, j'ai eu recours à 2 modèles d'induction de mort des cellules p:le traitement de cellules d'îlots avec la streptozotocine, un agent censé tuer spécifiquement les cellules p, ou l'utilisation de souris transgéniques (RIPrt TA-tetDTA) chez lesquelles la mort des cellules p peut être induite par administration de doxycycline. Le premier modèle s'avère inadéquat car la streptozotocine devient toxique pour les cellules a lorsqu'elle est utilisée aux concentrations qui tuent totalement les cellules p. Par contre, le modèle de souris RIPrtTA-tetDTA semble fonctionner puisque l'administration de doxycycline induit le diabète. Toutefois, je n'ai pas eu le temps d'évaluer l'effet de ce traitement sur la sécrétion de glucagon.

Somatostatin --- KATP Channels --- Glucose

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Om zich voor te bereiden op bevruchting, ondergaat de eicel een ontwikkelingsproces met verschillende cytoplasmatische en morfologische veranderingen. De Ca2+ vrijzettingscapaciteit van de eicel wordt geoptimaliseerd zodanig dat de spermacel de intracellulaire Ca2+ concentratie ([Ca2+]i) oscillaties kan induceren in de volledig ontwikkelde eicel. De gerijpte eicel, die in zoogdieren geblokkeerd is in de metafase van de 2de meiotische deling, versmelt met de spermacel waardoor fosfolipase C z vrijgezet wordt. Fosfolipase C z hydrolyseert fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat in inositol 1,4,5-trisfosfaat (IP3) en diacylglycerol. Vervolgens zal IP3 binden aan de IP3 receptor type 1 (IP3R1), welke het belangrijkste betrokken intracellulair Ca2+-kanaal is, en zal deze Ca2+ vrijzetten in het cytosol. De hoeveelheid Ca2+ die kan vrijgegeven worden na binding van een bepaalde hoeveelheid IP3 (ook IP3R1 gevoeligheid genoemd) stijgt tijdens het ontwikkelingsproces van de eicel. Verschillende factoren, die hier voor verantwoordelijk kunnen zijn, worden aangehaald, zoals o.a. IP3R1 densiteit, IP3R1 verdeling, de hoeveelheid Ca2+ in het endoplasmatisch reticulum en recent ook fosforylatie van de IP3R1 op een MPM-2 epitoop door M-fase kinasen. Vermits de [Ca2+]i-oscillaties cel-cyclus afhankelijk zijn en de M-fase kinasen de cel-cyclus controleren, is het best mogelijk dat deze M-fase kinasen ook de IP3R1 gevoeligheid regelen. Deze hypothese werd verder uitgewerkt en we hebben vastgesteld dat IP3R1 gefosforyleerd wordt op een MPM-2 epitoop tijdens de beginfase van het ontwikkelingsproces van de eicel. Deze fosforylatie is maximaal op het tijdstip van bevruchting, terwijl op het moment dat de eicel in interfase gaat en de oscillaties stoppen, deze MPM-2 fosforylatie ook verdwijnt. Bovendien hebben we polo-like kinase 1 (Plk1) geidenficeerd als het belangrijkste MPM-2 genererende kinase voor de initiële MPM-2 fosforylatie van IP3R1. Ook cyclin-dependent kinase 1 lijkt de IP3R1 te fosforyleren op een MPM-2 epitoop. We suggereerden ook dat, vooraleer Plk1 de IP3R1 kan fosforyleren, Plk1 eerst moet binden aan een gefosforyleerd motief in de IP3R1. Dit bindingsmotief wordt waarschijnlijk gefosforyleerd door Plk1 zelf, waardoor het sterk kan binden. Plk1 zal vervolgens de IP3R1 fosforyleren op T2656, welke we geidentificeerd hebben als een in vitro Plk1 fosforylatieplaats van zowel IP3R1 als IP3R3. We hebben tevens vastgesteld dat actief mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK) nodig is om de MPM-2 fosforylatie van IP3R1 te behouden in het MII stadium. In dit opzicht is het belangrijk dat het M-fase kinase MAPK de colocalisatie van IP3R1 en Plk1 regelt in dit stadium en daardoor zo Plk1-gemedieerde MPM-2 fosforylatie kan bevorderen. Verder hebben we aangetoond dat actief MAPK ook nodig is voor de vorming van IP3R1 corticale clusters in het MII stadium. Deze clusters dragen waarschijnlijk bij tot het verhogen van de gevoeligheid van de IP3R1. In overeenstemming met de suggestie dat MPM-2 fosforylatie van IP3R1 de gevoeligheid van de receptor kan beinvloeden, stelden we vast dat inhibitie van zowel MAPK als Plk1 de Ca2+ vrijzettingscapaciteit van de eicel verlaagde. Inactivatie van Plk1 door de specifieke inhibitor BI2536 verminderde de IP3R1 MPM-2 reactiviteit in de beginstadia van het ontwikkelingsproces en verlaagde bijgevolg ook de IP3R1 gevoeligheid. Inhibitie van de MAPK signaaloverdracht beïnvloedde zowel MPM-2 fosforylatie als corticale clustervorming van IP3R1 in het MII stadium en deze inhibitie resulteerde in een verlaagde spermacel-geinduceerde [Ca2+]i respons van de eicel. Daarom kunnen we besluiten dat de M-fase kinasen, die meiose regelen, een belangrijke rol spelen in het verhogen van de gevoeligheid van de IP3R1, en dus ook in de capaciteit van de eicel om [Ca2+]i oscillaties te kunnen genereren op het moment van bevruchting, en dit door zowel de MPM-2 fosforylatie als de lokalisatie van IP3R1 te beinvloeden tijdens het ontwikkelingsproces van de eicel. During the process of maturation, the oocyte undergoes several cytoplasmic and morphological changes to prepare itself for fertilization. Consequently, the oocyte's Ca2+-release machinery is optimized to allow the intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) oscillations induced by the sperm. The sperm induces [Ca2+]i oscillations into the mature egg, which is arrested at the metaphase of the 2nd meiotic division in mammals, by releasing phospholipase C z. The latter hydrolyses phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate into inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) and diacylglycerol. Subsequently, IP3 binds to the IP3 receptor type 1 (IP3R1), which is the main Ca2+ channel implicated, and which releases Ca2+ into the cytosol. The amount of Ca2+ released upon binding of a given amount of IP3 (referred to as IP3R1 sensitivity) increases during oocyte maturation. Several factors have been put forward to explain this increased sensitivity, e.g. the IP3R1 density, IP3R1 distribution, Ca2+ content of the endoplasmic reticulum and recently also phosphorylation of IP3R1 at an MPM-2 epitope by M-phase kinases. Since the [Ca2+]i oscillations are cell-cycle dependent and the M-phase kinases control the cell-cycle, it is entirely possible that those M-phase kinases also regulate IP3R1 sensitivity. We expanded this idea in this thesis and found that IP3R1 is phosphorylated at an MPM-2 epitope at the beginning of oocyte maturation, being maximal at the time of fertilization, while at the time that the egg enters interphase and the oscillations stop, this MPM-2 phosphorylation disappeared again. Additionally, we identified polo-like kinase 1 (Plk1) as the major MPM-2 generating kinase responsible for the initial MPM-2 phosphorylation of IP3R1. Moreover, we pointed out that cyclin-dependent kinase 1 might also phosphorylate the IP3R1 at an MPM-2 epitope. We also suggested that in order to phosphorylate IP3R1, Plk1 needs to bind first to a phosphorylated motif of IP3R1 (also referred to as a docking motif). This docking motif is probably phosphorylated by Plk1 itself, which then strongly binds to it. Subsequently Plk1 phosphorylates the IP3R1 at T2656, which we identified as an in vitro Plk1 site of both IP3R1 and IP3R3. We also found that active MAPK is important to maintain IP3R1 MPM-2 phosphorylation at the MII stage. Importantly, the M-phase kinase MAPK regulated the colocalization of IP3R1 and Plk1 at this stage and thereby it can strengthen the Plk1-mediated MPM-2 phosphorylation. Additionally, we demonstrated that active MAPK is also needed for the formation of IP3R1 cortical clusters at the MII stage and these clusters are probably also involved in the increased sensitivity of the IP3R1. In agreement with the suggestion that MPM-2 phosphorylation of IP3R1 increases its sensitivity, the inhibition of MAPK or of Plk1 affected the Ca2+-release capability of the oocyte/egg. Inactivation of Plk1 by the specific inhibitor BI2536 decreased the IP3R1 MPM-2 reactivity at the beginning of oocyte maturation and consequently also reduced the IP3R1 sensitivity. Inhibition of the MAPK pathway affected both MPM-2 phosphorylation and cortical cluster formation of IP3R1 at the MII stage and this inhibition resulted in a decreased sperm-induced Ca2+ response of the egg. Therefore, we conclude that the M-phase kinases, which regulate meiosis, play an important role in preparing the IP3R1 of the oocyte to give rise to the sperm-induced [Ca2+]i oscillations at the time of fertilization, and this by affecting both the phosphorylation and localization status of the IP3R1 during oocyte maturation. Om zich voor te bereiden op fertilisatie moet de primaire eicel zich eerst ontwikkelen tot een gematureerde eicel. Tijdens dit ontwikkelingsproces wordt ook de Ca2+ vrijzettingscapaciteit van de eicel geoptimaliseerd. Dit is nodig omdat, voor fertilisatie en verdere embryonale ontwikkeling te laten plaatsgrijpen, de spermacel een zeer specifieke Ca2+ respons moet kunnen induceren in de eicel. De moleculaire mechanismen verantwoordelijk voor deze optimalisatie zijn echter nog niet gekend. Het Ca2+ kanaal verantwoordelijk voor dit sperma-geinduceerde Ca2+ signaal is de inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 (IP3R1), en de sensitiviteit van dit kanaal om Ca2+ vrij te zetten stijgt ook tijdens het ontwikkelingsproces. We hebben nu aangetoond dat dit kanaal gefosforyleerd wordt door het M-fase kinase polo-like kinase 1 (Plk1) en dat deze fosforylatie de sensitiviteit van IP3R1 verhoogt tijdens de maturatie. Ook hebben we vastgesteld dat een andere kinase, MAPK, deze Plk1-gemedieerde fosforylatie reguleert door de colokalisatie van Plk1 en IP3R1 te beïnvloeden. Bovendien blijkt MAPK ook belangrijk te zijn voor de vorming van IP3R1 corticale clusters, en deze kunnen ook een rol spelen in de Ca2+ vrijzettingscapaciteit van de eicel. Daarom kunnen we concluderen dat verschillende M-fase kinasen een belangrijke rol spelen in de optimalisatie van de Ca2+ vrijzettingscapaciteit van de eicel, door de gevoeligheid van de IP3R1 te verhogen via ofwel fosforylatie of lokalizatie van de IP3R1 te beïnvloeden. Het begrijpen van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze optimalisatie heeft bovendien ook mogelijk sterke implicaties in de reproductieve biologie, waaronder in vitro fertilisatie technieken. The oocyte needs to mature to an egg in order to be ready for fertilization. During this maturation process, several changes occur and one of them is the increase in the capability to release Ca2+ in the cytosol. This is necessary since, for fertilization and correct subsequent development to occur, the sperm needs to trigger a very precise Ca2+ response in the egg. However, the molecular mechanisms responsible for this increase in capability are not yet known. The Ca2+ channel responsible for most of the sperm-induced Ca2+ release is the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 (IP3R1) and this channel's sensitivity to release Ca2+ is enhanced during maturation. We now found that this channel becomes phosphorylated during oocyte maturation by the M-phase kinase polo-like kinase 1 (Plk1) and that this phosphorylation enhances the sensitivity of the IP3R1. We also demonstrated that another kinase, MAPK, regulates the Plk1-mediated phosphorylation of the channel by influencing the colocalization of IP3R1 and Plk1 in the matured egg. Moreover, MAPK also affects the formation of IP3R1 cortical clusters, and this is another important factor regulating the Ca2+ release capability of the egg. Therefore, we can propose a model in which several M-phase kinases play a role in the optimization of the Ca2+ release machinery of the egg, either directly by enhancing the IP3R1 sensitivity through phosphorylation or indirectly by determining IP3R1 localization. Interestingly, understanding the mechanisms responsible for the optimization of the Ca2+ release machinery of the egg can also have potentially strong implications for reproductive biology, including in vitro fertilization techniques.