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De par le monde, de nombreux peuples se nourrissent d'insectes depuis plusieurs millénaires. Les insectes pourraient aussi être une source alternative de protéines pour nourrir les animaux d'élevage, mais également constituer un aliment de substitution pour l'être humain ; le système agricole et d'élevage actuel ne permettant pas de répondre aux besoins engendrés par la croissance démographique attendue. Ainsi, de nombreuses entreprises se sont déjà lancées dans la production d'insectes à des échelles très diverses. La plupart des plans d'affaires pour la production de farines d'insectes pour l'alimentation des animaux se basent sur la mouche soldat noire (Hermetia illucens) ou le ver de farine (Tenebrio molitor). En Europe, ces nouveaux aliments ne sont pas encore autorisés. Avant une autorisation dans nos régions, de nombreuses questions doivent en effet être clarifiées concernant la sécurité du consommateur. L'AFSCA tolère 10 espèces en Belgique, mais les opinions varient en fonction des pays européens (AFSCA, 2016). Pour permettre une introduction de ces aliments sur le marché européens, il importe de développer des méthodes permettant la détection et l'authentification de ces ingrédients à base d'insectes. La réglementation n°51/2013 de la Commission Européenne a reconnu la réaction de polymérisation en chaîne comme méthode de référence, à côté de la microscopie classique, pour déterminer la présence de constituants d'origine animale dans les aliments pour animaux. Dans ce travail, différentes cibles ont été évaluées par bio-informatique et par PCR en temps réel. Ainsi, un total de 12 cibles ont été conçues, réparties en 4 grandes catégories : les cibles globales permettant de reconnaître une grande diversité d'espèces (18s-INS, Duplex 1 et Duplex 2), les cibles spécifiques à l'ordre des Diptères (18s-DIPT et 1α-DIPT) et les cibles capables de reconnaître spécifiquement T. molitor (TM-COI, TM-WING, Cadherin-Genesig et Cadherin-CRAW) ou H. illucens (COI-HERM, HI-MITO et HI-MITO2). Pour la première catégorie de cibles censées reconnaître une grande diversité d'insectes, les 3 systèmes conçus se basent sur le gène codant pour l'ARN 18s. Dans un premier temps, la cible 18s-INS a été évaluée, reconnaissant l'ensemble des insectes à l'exception des Diptères. L'étude de la limite de détection de cette cible confirme le caractère multi-copies du gène codant pour l'ARN 18s. Dans le but d'élargir le panel d'insectes reconnus, il a été envisagé d'utiliser simultanément 2 sondes : l'une reconnaissant les Diptères, et l'autre le reste des insectes. Cette expérience correspond aux systèmes Duplex 1 et 2. Leur spécificité a été évaluée avec succès sur une cinquantaine d'espèces d'insectes et sur dix produits commerciaux à base d'insectes. Cependant,des aspécificités ont été remarquées avec certains végétaux tels que le froment ou la tomate. Des tentatives d'optimisation ont été menées, mais sans succès jusqu'à aujourd'hui. Ensuite, deux systèmes spécifiques à l'ordre des Diptères ont également été testés, basés sur l'ARN 18s et le facteur d'élongation 1α, mais aucune de ces cibles n'a fourni de résultat d'intérêt. Pour les cibles spécifiques à T. molitor, les gènes visés sont la sous-unité I du cytochrome C oxydase, le gène wingless et le gène codant pour la cadhérine, pour lequel deux systèmes PCR ont été évalués. Les cibles Cadherin-CRAW et TM-WING se sont montrés totalement spécifiques à T. molitor. La limite de détection de ces dernières a été évaluée comme étant inférieure ou égale à 20 copies. Enfin, dans le cas de H. illucens, les sous-unités I et III du cytochrome C oxydase ont été ciblées. Cependant, seule la cible HI-MITO2 a montré un potentiel intéressant, 2 aspécificités restant à éliminer.

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Fournir des aliments sûrs aux consommateurs reste un défi clé de nos jours, avec la volonté de favoriser les produits naturels et les denrées alimentaires exemptes d'additifs. Parmi les maladies d'origine alimentaire, la listériose est la cinquième plus importante dans l'Union Européenne en termes d'occurrence, avec plus de2.500 cas rapportés en 2018. Listeria monocytogenes, le pathogène responsable de cette maladie, peut être transmis par diverses denrées alimentaires prêtes à être consommées, notamment les produits laitiers. En tant que vecteurs potentiels de L. monocytogenes, les fromages doivent satisfaire aux critères microbiologiques définis dans le Règlement (CE) N° 2073/2005. Par défaut, les fromages sont considérés comme des denrées alimentaires prêtes à être consommées permettant la croissance du pathogène au cours de leur durée de vie. En conséquence, les producteurs doivent garantir la non-détection de L. monocytogenes au sein de leurs fromages avant leur mise sur le marché. Cependant, diverses études étrangères ont permis d'identifier des variétés de fromages ne permettant pas cette croissance, et assurant même parfois une baisse des niveaux de contamination durant le stockage. Les fromages belges, en particulier les produits artisanaux, sont relativement inconnus, bien que ce pays possède une riche diversité de variétés de fromage et de producteurs. Ainsi, peu de données sont disponibles en ce qui concerne le comportement de L. monocytogenes dans ces aliments. Les variétés belges de fromage sont donc considérées comme des aliments permettant la croissance de L. monocytogenes en cours de stockage réfrigéré. Bien que nécessaires pour garantir la sécurité des consommateurs, les critères d'hygiène des denrées alimentaires constituent une épée de Damoclès permanente au-dessus de la tête des producteurs. La détection de L. monocytogenes peut en effet engendrer de graves conséquences économiques et morales. L'objectif principal de cette thèse de doctorat a donc été d'évaluer la croissance de L. monocytogenes dans différentes variétés artisanales de fromages belges, et de comprendre les principaux facteurs l'influençant. Premièrement, une enquête téléphonique a été réalisée auprès de 142 producteurs belges de fromage artisanal, fournissant des connaissances générales sur les producteurs, les procédés de fabrication et les variétés. Globalement, 16 grands types de fromage ont été identifiés. Un tiers des variétés correspondaient à des pâtes lactiques fraîches. Un autre tiers était constitué par les fromages à pâte pressée non cuite, incluant les types Saint-Paulin et Gouda, principalement retrouvés en Wallonie et en Flandre, respectivement. Les pâtes molles représentaient près de18 % des variétés identifiées lors de l'enquête. Enfin, des variétés mineures ont également été répertoriées, incluant les pâtes pressées mi-cuites et cuites, les bleus, la Ricotta, la Mozzarella, le Halloumi et la Feta. Sur base des ces données, 65 variétés ont été sélectionnées pour une caractérisation plus approfondie. Ainsi, les fromageries concernées ont été visitées et les procédés de fabrication ont été suivis. Enfin, des échantillons de produits finis ont été prélevés pour être caractérisés physico-chimiquement. Parmi ces 65 variétés fromagères, seules deux présentaient des caractéristiques physico-chimiques permettant naturellement une inhibition de la croissance de L. monocytogenes, i.e. un pH ≤ 4,4, ou une aw ≤ 0,92, ou enfin un pH ≤ 5,0 et une aw ≤ 0,94. Cela signifie donc que la majorité des variétés permettent théoriquement la croissance du pathogène, confirmant l'intérêt de la présente thèse. Les données collectées n'ont pas permis d'améliorer les outils de classification des fromages actuellement disponibles. Après cela, 32 variétés représentatives de la diversité des fromages artisanaux belges ont été sélectionnées en vue d'évaluer la croissance de L. monocytogenes en leur sein. Il a été décidé de réaliser des tests de provocation à cette fin, impliquant une contamination artificielle des fromages par L. monocytogenes. Brièvement, trois lots de chaque variété ont été étudiés, à l'exception des variétés pour lesquelles les outils informatiques de prédiction de croissance avaient au préalable démontré l'impossibilité pour le pathogène de s'y développer. Pour chaque lot, 12 pièces ont été prélevées. Six ont été artificiellement inoculées, les autres servant de témoins. L. monocytogenes a été dénombrée les premier et derniers jours de stockage à8 ± 1 °C, permettant de déterminer le potentiel de croissance du pathogène pour chaque lot. Il a été conclu que les pâtes lactiques fraîches permettaient systématiquement une décroissance des niveaux de contamination par L. monocytogenes. Par le biais d'une nouvelle circulaire, ce type de fromage est maintenant reconnu comme sûr pour la santé humaine par l'Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaîne Alimentaire. Un niveau maximal de 100 ufc/g de L. monocytogenes est maintenant toléré pour ces produits. Les résultats relatifs aux autres types de fromages ont été plus controversés. Globalement, les fromages à pâte molle ont permis la croissance du pathogène jusqu'à des niveaux dangereux. Néanmoins, trois lots d'un Herve au lait cru ont présenté une décroissance des niveaux de contamination. Concernant les fromages à pâte mi-dure, une grande variabilité a été observée entre variétés, entre lots et entre pièces. Les paramètres physico-chimiques et les données associées aux procédés de fabrication n'ont pas permis de comprendre ces différences. Il a été choquant de constater que les méthodologies actuellement détaillées par le Laboratoire de Référence de l'Union européenne pour L. monocytogenes ne permettaient pas de tenir compte de cette variabilité en déterminant les risques liés à une denrée. Une révision de ces méthodes devrait être à l'ordre du jour afin de garantir de façon efficace la sécurité des consommateurs. Il a été décidé de s'intéresser au microbiote des fromages, en vue d'identifier des espèces bactériennes ou des consortia pouvant potentiellement inhiber L. monocytogenes. Au moyen des nouvelles technologies de séquençage, la richesse et la diversité bactérienne ont été déterminées au niveau du genre. Ces deux paramètres étaient significativement plus élevés au sein des fromages à pâte molle en comparaison aux autres types. De façon surprenante, la diversité bactérienne était très faible dans les fromages à pâte mi-dure, et l'étude du microbiote n'a pas permis de formuler des hypothèses intéressantes expliquant la variabilité observée pour ces produits. En ce qui concerne le Herve, la métagénétique a révélé la présence d'une bactérie inconnue appartenant au genre Fusobacterium, avec une abondance relative de l'ordre de 10 %.Une hypothèse a été de se dire que la présence de cette bactérie pourrait expliquer les observations surprenantes réalisées précédemment, concernant la décroissance des niveaux de L. monocytogenes lors du stockage de ces produits. Néanmoins, nous ne sommes pas parvenus à isoler la bactérie concernée. La métagénomique appliquée sur les extraits d'ADN obtenus à partir du fromage a permis d'assembler et d'annoter le génome théorique de cette bactérie. L'identité nucléotidique et l'arbre phylogénomique ont suggéré qu'elle pourrait appartenir à une nouvelle espèce du genre Fusobacterium. La comparaison de protéomes a permis d'identifier des familles protéiques, voies métaboliques et sous-systèmes potentiellement non partagés avec d'autres espèces de Fusobacterium. Néanmoins, sans être parvenu à isoler la bactérie, il demeure impossible de décrire la nouvelle espèce, ainsi que d'évaluer son rôle potentiel dans l'inhibition observée de L. monocytogenes au sein de ce fromage de Herve. Globalement, bien que des marqueurs aient pu être identifiés pour les pâtes lactiques fraîches, il n'a pas été possible de déterminer des facteurs individuels pouvant affecter la croissance ou l'absence de croissance de L. monocytogenes au sein des fromages à pâte mi-dure. Il est possible que son comportement soit plutôt affecté par l'interaction complexe entre différents facteurs intrinsèques à chaque variété de fromage et permettant ainsi de fournir une barrière suffisante à la croissance du pathogène. Cette thèse a contribué à la connaissance globale relative aux fromages artisanaux belges, en lien avec L. monocytogenes, mais pas mal de pistes peuvent encore être explorées durant les prochaines années, concernant la recherche fondamentale mais aussi le développement de lignes directrices et normes universelles plus appropriées.

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voir SLB-006936

Bâtiment de bureaux --- Analyse urbaine --- Auderghem

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Suite à la demande de certains producteurs wallons de beurre au lait cru confrontés à un problème récurrent de contamination de leur produit en E. coli, DiversiFerm a souhaité étudier cette problématique pour mieux la comprendre et pouvoir apporter aux producteurs des conseils afin d’y remédier. L’étude de la contamination en E coli du beurre au lait cru fait l’objet de ce travail. 
E. coli est une bactérie dont la présence ou non est un indicateur d’hygiène du procédé de fabrication. Les normes énoncées dans le Règlement (CE) n°2073/2005 encadrent le taux de contamination dans les denrées alimentaires afin d’offrir une garantie d’hygiène aux consommateurs. 
Le processus de fabrication du beurre compte plusieurs étapes : la traite, qui n’entre pas dans le cadre de ce travail, l’écrémage, la maturation, le barattage, le lavage, le malaxage et le conditionnement. L’étude repose sur le suivi de trois cycles de production de beurre au lait cru dans six fermes distinctes confrontées à la présence répétée d’E. coli dans le beurre produit. La méthode de travail pour cette étude a consisté à prélever des échantillons de surfaces (cinq points de prélèvement et trois répétitions) et des produits présents au cours du processus de fabrication du beurre : lait entier, crème, lait écrémé, crème maturée et beurre (cinq répétitions par produit). Ces prélèvements ont eu lieu à différentes étapes du processus de fabrication, à savoir avant et après l’écrémage, après la maturation et après le barattage. La présence et les dénombrements de E. coli ont été réalisés à l’aide de Petrifilms. La contamination mesurée traduit la qualité du nettoyage de l’équipement en ce qui concerne les 
échantillons de surfaces, et de la qualité microbiologique pour cette bactérie dans les produits laitiers. 
Selon la classification du règlement européen, sur les 18 lots de beurres échantillonnés et testés dans cette étude, un seul lot était de qualité satisfaisante, trois étaient acceptables et les 14 autres insatisfaisants, soit 78%. 
Les résultats des prélèvements de surfaces montrent qu’un point critique de contamination est le 
tuyau d’arrivée du lait entier. Un deuxième point a pu être mis en évidence : l’orifice de passage du lait entier vers l’écrémeuse. La propreté de ces deux points est donc primordiale. Pour ce qui est de la contamination en E. coli dans les produits laitiers, l’étude a essayé d’identifier les facteurs pouvant l’influencer. Une corrélation pour le taux d’E. coli ou de coliformes a pu être établie par régression linéaire entre plusieurs couples de produits. Des tests statistiques ANOVA ont, eux, permis de révéler l’importance de la qualité microbiologique en E. coli du lait entier utilisé, la qualité étant liée dans cette étude au type d’équipement de traite utilisé (salle ou robot de traite) et à la propreté de cet équipement évaluée à la sortie du lactoduc. En effet, dans les exploitations de l’étude utilisant des robots, le lait entier était mis en attente d’être écrémé dans un réservoir tampon pendant plusieurs heures sans refroidissement, permettant ainsi le développement d’E. coli. Des tests GLM ont montré l’impact favorable de l’utilisation de ferments pour la maturation de la crème. Enfin, l’effet du mélange de différents lots de crème maturée pour un même barattage a également pu être mis en évidence dans les résultats. 
Des pistes de solution ont été émises pour remédier à la contamination en E. coli chez les producteurs de l’étude. Celles-ci pourraient être appliquées à d’autres producteurs confrontés à une problématique semblable. Ces pistes consistent en l’amélioration du nettoyage de l’équipement, la diminution du temps d’attente du lait entier non refroidi avant l’écrémage, et l’ensemencement de la crème avec des ferments lactiques pour la maturation. 
Des études ultérieures pourront approfondir le sujet et vérifier les hypothèses émises. Following the request of some Walloon raw milk butter producers faced with a recurrent problem of E. coli contamination of their product, DiversiFerm wished to study the issue to understand it better and to be able to provide producers with recommendations to remedy it. The study of Escherichia coli contamination in raw milk butter is the subject of this paper. 
E. coli is a bacterium whose presence or absence is an indicator of hygiene for the manufacturing process. The standards set out in Regulation (EC) No 2073/2005 govern the level of contamination in food products in order to provide consumers with a guarantee of hygiene. 
The butter manufacturing process includes several stages: milking, which is outside the scope of this work, skimming, maturation, churning, washing, kneading and packaging. 
The study relies on the monitoring of three production cycles of raw milk butter on six different farms faced with the repeated presence of E. coli in the resulting butter. The method of work for this study consisted of taking samples of surfaces (five sampling points and three repetitions) and samples of the products present during the butter production process: whole milk, cream, skimmed milk, ripened cream and butter (five repetitions per product). These samples were taken at different stages of the manufacturing process, i.e. before and after skimming, after maturation and after churning. The E. coli in the samples were cultured on Petrifilm on the same day so that they could be enumerated. The level of E. coli measured on the Petrifilms reflects the quality of the cleaning of the equipment for the surface samples and the microbiological quality for this bacterium in the dairy products. Based on the classification of the European Regulation, out of 18 batches of butter sampled and tested in this study, only one batch was of satisfactory quality, three were acceptable and the other 14 unsatisfactory, i.e. 78%. 
The results of the surface sampling show that a critical point of contamination is the whole milk supply pipe. A second point was found to be the whole milk inlet to the skimmer. The cleanliness of these two points is therefore of paramount importance. As for E. coli contamination in dairy products, the study tried to identify possible contributing factors. A correlation for E. coli or coliform levels could be established by linear regression between several product pairs. Statistical ANOVA tests revealed the importance of the microbiological quality in E. coli of the whole milk used, the quality being linked in this study to the type of milking equipment used (parlour or milking robot) and to the cleanliness of this equipment rated at the outlet of the milk duct. 
Indeed, on those farms participating in the study which use robots, the whole milk was left to stand in the buffer tank for several hours without cooling before skimming, thus allowing the development of E. coli. GLM tests showed the favorable impact of using ferments for cream maturation. Finally, the effect of mixing different batches of ripened cream for the same churning could also be seen in the results. 
Suggestions for solutions to the E. coli contamination of the producers in the study were made. 
These solutions may be applicable to other producers facing a similar problem. The solutions include improving equipment cleaning, reducing the waiting time of uncooled whole milk before skimming, and inoculating the cream with lactic ferments for maturation. 
Additional studies may further investigate the subject and verify the hypotheses.

Beurre --- Lait cru --- Escherichia coli --- E. coli --- Petrifilm --- Hygiène alimentaire --- Normes microbiologiques --- Butter --- Raw milk --- Escherichia coli --- E. coli --- Petrifilm --- Food safety --- Microbiological standards --- Sciences du vivant > Microbiologie