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Les protéines recombinantes (rProt) revêtent une importance capitale (comme produit fini et comme catalyseur) dans les domaines de la pharmaceutique, de la chimie, des cosmétiques, de l'alimentation humaine et animale, et du traitement des déchets. Pour des raisons de qualité, une partie de ces protéines est produite par des systèmes-hôtes levuriens, tels Saccharomyces cerevisiae et Pichia pastoris (syn. Komagataella sp.). Outre ces hôtes établis, la levure non-conventionnelle Yarrowia lipolytica représente une usine cellulaire prometteuse pour la production de rProt. En effet, Y. lipolytica synthétise et sécrète des protéines de manière substantielle, jusqu'à 1-2 g·L-1. De plus, certains des inconvénients inhérents à ses prédécesseurs (hyperglycosylation élevée, effet Crabtree, dépendance au méthanol pour induire l'expression hétérologue) sont absents chez Y. lipolytica. Néanmoins, un manque de vue d'ensemble et d'outils spécifiques pour répondre aux exigences de cette levure l'empêchent toujours d'atteindre son plein potentiel de production de rProt. Dans le cadre de cette thèse, deux problèmes majeurs de la production de rProt chez Y. lipolytica ont été sélectionnés et traités : l'absence de promoteurs inductibles pratiques et la difficulté à maîtriser le dimorphisme au cours des processus en bioréacteur. Ces deux problèmes d'ordre pratique ont été résolus suite à la découverte et au détournement d'un gène de sa fonction primaire. Dans un premier temps, l'identification et la caractérisation du gène EYK1 dans le cadre du métabolisme de l'érythritol et de l'érythrulose chez Y. lipolytica ont conduit au développement de promoteurs régulés par ces polyols. Leur facilité d'utilisation et leur polyvalence se révèlent correspondre aux critères de production d'une large gamme de rProt. En utilisant une souche-hôte et des plasmides adaptés à l'expression inductible par l'érythritol et l'érythrulose, environ 45 000 U·mL-1 de lipase CalB sécrétée - le rendement le plus élevé jamais atteint chez la levure - ont été obtenus en 24 h dans un bioréacteur planctonique en mode batch. Deuxièmement, la découverte du gène YlHsl1 a permis d'obtenir des cellules mutantes bloquées dans une morphologie pseudohyphale (ne pouvant plus changer de conformation en réponse à des stimuli environnementaux). Ces cellules s'adaptent parfaitement à la croissance à l'état immobilisé au sein du bioréacteur, ce qui constitue un atout supplémentaire pour les bioprocédés continus et simplifie le traitement en aval des protéines sécrétées. Enfin, le système d'expression induit par l'érythritol développé pour Y. lipolytica au cours de cette thèse a été directement comparé pour la première fois à celui de P. pastoris, pour leur capacité à produire des rProt (ici la lipase CalB). La comparaison a révélé un titre de lipase CalB sécrétée 5 fois plus élevé dans les cultures en bioréacteur de Y. lipolytica que dans celles de P. pastoris, confirmant l'efficacité de Y. lipolytica pour la production de rProt.

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L'astine C est un peptide cyclique assemblé au cours d'un mécanisme non-ribosomique par une synthétase dite NRPS (NonRibosomal Peptide Synthetase). Ce peptide non-ribosomique possède des propriétés thérapeutiques intéressantes avec notamment des activités anti-tumorale et anti-inflammatoire. Jusqu'ici ce composé était exclusivement extrait à partir des racines d'Aster tataricus, une plante utilisée traditionnellement en médecine japonaise et chinoise. Récemment, une production d'astine C a été mise en évidence chez Cyanodermella asteris, un champignon endophyte de cette plante. Cette découverte ouvre de nouvelles perspectives en matière de production d'astine C, qui reste néanmoins très limitée en raison du faible taux de croissance du champignon endophyte. Au cours de cette étude, deux approches ont été développées parallèlement afin d'augmenter les taux de production de l'astine C. La première stratégie consistait à augmenter les rendements en optimisant la production homologue à partir de C. asteris. Dans cette optique, un système de culture a été établi afin de cultiver le champignon exclusivement sur un support en acier inoxydable. Ce mode de culture a favorisé à la fois le développement de la biomasse fongique et la production du composé d'intérêt. En vue d'optimiser ce procédé, l'impact de plusieurs paramètres de culture (modalité de préparation du support, type d'inoculum, pH de culture, et composition du milieu de culture) sur la production d'astine C a été évalué. Les paramètres de culture optimisés ont permis d'améliorer de nouveau les rendements en astine C, ce qui constitue une première étape dans le développement d'un procédé de production à l'échelle industrielle. En parallèle, des travaux ont été menés afin de développer un système de production hétérologue d'astine C chez la levure. Cette approche n'a pu être considérée qu'après avoir identifié, par le biais d'analyses bioinformatiques, les gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de l'astine. Une fois ces gènes identifiés, une revue de la littérature a permis, entre autres, de dresser un bilan des outils moléculaires disponibles pour le clonage des larges séquences nucléiques codant pour les NRPSs, et de sélectionner des hôtes hétérologues appropriés. Des séquences complètes ou partielles du gène codant pour l'astine synthétase ont été clonées respectivement chez Saccharomyces cerevisiae et Yarrowia lipolytica. Pour les deux levures considérées, une expression hétérologue a été constatée. Chez S. cerevisiae, la synthèse de la NRPS d'astine n'a pas pu être démontrée. En revanche, pour la première fois, la production d'une structure de type NRPS chez Y. lipolytica a pu être mise en évidence. Bien qu'aucun peptide non-ribosomique n'ait été détecté, cette étude a permis de lever une partie des verrous limitant le développement d'un mode de production hétérologue d'astine chez la levure.

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Plants and endophyte micro-organisms have been used for thousands of years to produce compounds for medicinal purposes. In this work, the optimization of the production of an anticancerous molecule, astin C, by Cyanodermella asteris, an endophyte fungus to the plant Aster tatricus, was studied. Firstly, a detection technique of astin was developed, by combining analysis with HPLC-UV and UPLC-MS. Then, in flasks, two types of fungal growth were studied, planktonic and in a biofilm, as well as the medium concentration and the culture time. The comparison was done on the astin yield mainly, but also on the biomass one. It appears that the planktonic growth had a higher biomass yield while the biofilm growth has a higher astin yield. Furthermore, the higher the medium concentration and the culture time were, the higher the astin and biomass production were. With a pH value of 4, there was no growth while for a value of 5, the growth is smaller than the one observed without a set pH. Medium replacement after a certain amount of time was also tested, but led to a high standard deviation and thus to inconclusive results. Secondly, the reactor experiments allowed to highlight the importance of aeration for the growth and to confirm the capacity of the fungus to produce astin during a biofilm growth on a stainless steel support, but with a lower yield than during a flasks culture.
Thirdly, the consumption rate of the main elements of the culture medium was determined.

Cyanodermella asteris --- Aster tataricus --- anticancerous --- astin --- Sciences du vivant > Biotechnologie