Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

g-Secretase, een complex bestaande uit preseniline (PSEN), nicastrine (NCT), presenilin enhancer-2 (PEN2) en anterior pharynx defective-1 (APH1), klieft type I membraaneiwitten zoals het amyloïde voorlopereiwit en Notch via een proces van gereguleerde intramembraanproteolyse. De topologie van PSEN1 stond lange tijd ter discussie. We hebben dit opnieuw onderzocht door glycosylastiemotieven in PSEN1 in te bouwen en deze mutanten tot expressie te brengen in een PSENs-deficiënte achtergrond. Hierdoor toonden we aan dat PSEN1 negen transmembraandomeinen heeft met een luminale/extra-cellulaire COOH-terminus. Deze topologie konden we ondersteunen dmv lysine-mutagenese, oppervlaktebiotinylatie en cysteïnederivatisatie en is in overeenstemming met de diverse fysiologische functies geassocieerd met PSEN1. Gebaseerd op het glycosylatiepatroon van deze varianten hebben we tevens aangetoond dat PSEN1, na een conformationele verandering geïnduceerd door complexvorming, via het Golgi passeert. Dit leidde tot onze hypothese dat complexvorming gebeurd tijdens transport tussen het endoplasmatisch reticulum (ER) en het Golgi.   De vorming van multimere complexen wordt gemedieerd via kwaliteitscontrole-mechanismen in het ER en ook het Golgi. Het principe hierachter is dat monomeren weerhouden worden in het ER via de interactie met ER-Golgi of Golgi-ER cargoreceptoren. De juiste combinatie van die monomeren in een functioneel complex maskeert dan specifieke retentiesignalen wat toelaat dat het complex uit deze vroege compartimenten kan ontsnappen. In deze studie identificeren we een dergelijke kwaliteitscontrole in de stapsgewijze vorming van g-secretase met de karakterisatie van Rer1p als een nieuwe interactie-partner van NCT. Rer1p bindt bij voorkeur immatuur NCT via polaire aminozuren in haar transmembraandomein, die ook kritisch zijn voor de interactie met APH1. APH1 deficiëntie resulteert bijgevolg in een verhoogde interactie van NCT met Rer1p wat de competitie tussen Rer1p en APH1 voor NCT aantoont. Bovendien wordt de vorming van g-secretase complexen (en dus ook activiteit) gecontroleerd door de expressieniveau’s van Rer1p. Dit laat ons toe te besluiten dat Rer1p een nieuwe limiterende factor is die de vorming van g-secretase complexen negatief reguleert via competitie met APH1 tijdens ER-Golgi transport. Bijgevolg wordt g-secretase-activiteit ingeperkt door een secundair ER-kwaliteitscontrolesysteem met een mogelijk therapeutisch potentieel. Mits Rer1p wellicht functioneert in de vorming van andere, nog ongekende, complexen, hebben we haar fysiologische rol bestudeerd in zebravis. Rer1p komt sterk tot expressie in gecilieerde organen en specifieke onderdrukking ervan via morfolino’s resulteerde inderdaad in ontwikkelings-abnormaliteiten die hun oorsprong vinden in niet-functionerende cilia (waaronder links-rechts asymmetrie, doofheid en ongevoelige voorste laterale lijnorganen). Aangezien defecte cilia voorkomen in diverse syndromen, ook ciliopathieën genoemd, breidt dit de functie uit van Rer1p naar andere ziekten dan alleen Alzheimer. Tenslotte identificeerden we rer1 als één van de haploinsufficiënte genen in de meeste vormen van monosomie 1p36. Verschillende clinische kenmerken van deze ziekte worden ondermeer herkend in zebravis na Rer1p-onderdrukking wat doet vermoeden dat monosomie 1p36 veroorzaakt wordt door een onderliggende ciliopathie. g-secretase, consisting of presenilin (PSEN), nicastrin (NCT), presenilin enhancer-2 (PEN2), and anterior pharynx defective-1 (APH1), cleaves type I membrane proteins like amyloid precursor protein and Notch in a process of regulated intramembrane proteolysis. PSEN1 is a polytopic membrane protein, the topology of which remained an issue of controversy. We revisited this by inserting glycosylation consensus sequences in human PSEN1 and expressing the obtained mutants in a PSEN1 and 2 knock-out background. This approach proved that PSEN1 has a nine-transmembrane domain topology with an luminal/extracellularly exposed COOH-terminus. The same topology is underscored by lysine mutagenesis, cell surface biotinylation, and cysteine derivation strategies and is compatible with the different physiological functions assigned to PSEN1. Based on the glycosylation status of these variants we provide furthermore evidence that PSEN1 traffics through the Golgi after a conformational change induced by complex assembly. Based hereon, we hypothesize that complex assembly occurs during transport between the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. Assembly of multimeric complexes is mediated through quality control mechanisms in the ER, extending up to the Golgi. Unassembled subunits can be retained or retrieved to the ER through interaction with ER-to-Golgi or Golgi-to-ER cargo receptors. Proper combination of individual subunits into a functional complex, masks specific retention/retrieval motifs allowing assembled complexes to pass through the Golgi. Here we demonstrate the existence of at least one such quality control mechanism governing the multistep assembly of g-secretase through the characterization of the retrieval receptor Rer1p as a novel interaction partner for NCT. Rer1p binds preferentially immature NCT via polar residues within its transmembrane domain that are also critical for interaction with APH1. Absence of APH1 substantially increased binding of NCT to Rer1p, demonstrating the competitive nature of these interactions. Moreover, Rer1p expression levels control the formation of g-secretase (sub)complexes and concomitantly total cellular g-secretase activity. We identify Rer1p as a novel limiting factor that negatively regulates g-secretase complex assembly by competing with APH1 during active recycling between the ER and Golgi. We conclude that total cellular g-secretase activity is restrained by a secondary ER control system that provides a potential therapeutic value. As Rer1p function is likely implicated in the assembly of other yet unknown complexes we explored its physiological role in zebrafish. Due to Rer1p being highly expressed in all ciliated organs, specific downregulation using morpholino oligonucleotides resulted in several developmental abnormalities originating from dysfunctional or non-responsive cilia including laterality defects, deafness and insensitive anterior lateral line organs. Because defective cilia are recognized in numerous disorders, collectively known as ciliopathies, this finding unexpectedly links Rer1p to human diseases beyond Alzheimer’s disease. Furthermore, we identified human rer1 as one of the haploinsufficient genes included in most cases of monosomy 1p36. Since clinical features of this disease were recapitulated to a certain extent by rer1 knockdown in zebrafish we suggest that monosomy 1p36 might be caused by an underlying ciliopathy. Celbiologische benadering in de ontrafeling van de ziekte van Alzheimer en monosomie 1p36 De ziekte van Alzheimer is de meest voorkomende vorm van dementie in de geïndustrializeerde landen dat zwaar op de maatschappij doorweegt. De ziekte komt op in mensen ouder dan 65 jaar, maar er bestaan ook meer zeldzamere familiaal overerfbare vormen waar de ziekte zich op een veel vroegere leeftijd manifesteert. Niettegenstaande de mechanismen die de basis vormen van deze ziekte nog niet geheel zijn uigeklaard, focuseert een belangrijk deel van het onderzoek zich op het verlagen van de productie of het verhogen van de verwijdering van kleine toxische amyloïde peptiden die accumuleren in de seniele plakken van Alzheimerpatiënten. Deze korte fragmenten ontstaan uit een reeks klievingsprocessen in het zogenaamde amyloïde voorlopereiwit en deze worden gemedieerd door specifieke enzymatische activiteiten die we ‘secretasen’ noemen.   In dit werk hebben we één van deze secretasen, met name g-secretase, van naderbij bestudeerd. Dit enzyme staat in voor de laatste klievingsstap en bevrijdt dus het amyloïde peptide uit haar voorlopereiwit. Echter, g-secretase is een complex dat bestaat uit verschillende eiwitsubeenheden die op een welbepaalde manier moeten ‘geassembleerd’ worden in een functioneel enzymatisch complex. De vorming van dergelijke complexen is dan ook onderhevig aan diverse controlemechanismen die ook gerelateerd zijn aan het transport van dit complex doorheen de zenuwcel. We hebben hier eerst aangetoond dat de vorming van dit complex hoofdzakelijk moet gebeuren tijdens het transport doorheen de vroegste biosynthetische compartimenten van de cel. Vervolgens hebben we een eerste, en nieuw regulerende eiwit ontdekt, namelijk Rer1p, dat actief helpt in de assemblage van dit complex. Het Rer1p eiwit controleert zelfs op een negatieve manier de vorming van het complex waardoor het in deze functie ook de totale niveau’s van g-secretase-activiteit reguleert. In een opvolgende studie hebben we de rol van Rer1p kunnen uitbreiden van de ziekte van Alzheimer naar een andere aandoening, gekend als het monosomie 1p36 syndroom. Patiënten die leiden aan dit syndroom worden gekenmerkt door een complex clinisch fenotype waaronder enkele zeer frequent zoals mentale retardatie, vertraging in de ontwikkeling en spraak, doofheid en epilepsie. Hoewel een dergelijk complex klinisch beeld veroorzaakt kan worden door het verlies van verschillende genen, tonen we hier aan dat Rer1p wellicht een meer centrale plaats inneemt. Immers, door dit eiwit uit te schakelen in het zebravis diermodel, hebben we een aantal kenmerken van monosomie 1p36 geïnduceerd, ondermeer doofheid. Meer doorgedreven werk is echter nodig om na te gaan in welke mate zebravis als modelorganisme kan gebruikt worden om deze complexe ziekte beter te begrijpen. Cell biological approach in unraveling Alzheimer’s disease and monosomy 1p36 Alzheimer’s disease is the most common form of senile dementia in the industrialized world putting an increasing burden on society. The disease is diagnosed in people over 65 years of age, although less frequent early-onset disease also occurs in rare familial inherited cases. Although the mechanism behind the disease are not yet fully understood, a major part of the research focuses on decreasing the production or enhancing the clearance of short toxic amyloid peptides that accumulate in senile plaques in the patient’s brain. These short fragments are generated through cleavage events in a larger amyloid precursor protein which are mediated by specific enzyme activities, namely secretases. We studied here one of these key players, namely γ-secretase, which mediates the final cleavage event and liberates the toxic amyloid peptides from its precursor. However, γ-secretase is composed of several protein subunits that need to become assembled in one functional complex. The formation of such complexes is subject to several control mechanisms that are related to its transport in the nerve cell. We demonstrated that the assembly occurs in a controlled fashion. Moreover, we identified a first regulator –called Rer1p- that helps to assemble this complex. In fact, Rer1p negatively controls this complex formation and by doing so regulates the total levels of g-secretase activity in the nerve cells. In continuation of this research, we expanded the role of Rer1p in Alzheimer’s disease to another human disease known as monosomy 1p36. Patients with this disorder have a complex phenotype in which some of the features appear most frequently, such as mental retardation, developmental and speech delay, epileptic seizures and deafness. Such a complex phenotype is explained by the loss of numerous proteins, with Rer1p taking in a more central role. By depleting Rer1 protein in an animal model, namely zebrafish (Danio rerio), we recapitulated developmental delay and deafness seen in patients suggesting indeed the crucial role of this protein in proper embryonic and ear development. Further work will reveal whether other clinical features of monosomy 1p36 patients can be explained using the zebrafish model system.

Academic collection --- 612.8 --- 577 --- Nervous system. Sensory organs --- Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics --- Theses --- 577 Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

De geactiveerde vorm van Trombine Activeerbare Fibrinolyse Inhibitor (TAFIa) is een enzym met antifibrinolytische eigenschappen. TAFIa is een potentiële risicofactor voor cardiovasculaire aandoeningen omdat dit eiwit een belangrijke link vormt tussen bloedstolling en fibrinolyse. Aan de andere kant is specifieke inhibitie van TAFIa een veelbelovende strategie als adjuvans bij trombolytische therapie. De fysiopathologische rol van TAFI is echter nog niet volledig begrepen. De aanwezigheid van verschillende isovormen van TAFI in plasma verstoorden het resultaat van de verschillende technieken om het TAFI(a) gehalte in plasma te bepalen. Bijgevolg was het moeilijk om een link te creëren tussen TAFI en trombotische aandoeningen omdat het resultaat van de verschillende klinische studies contradictorisch bleek te zijn. Het gebruik van dierenmodellen kan helpen om de fysiopathologische rol van TAFI in vivo beter te begrijpen. Deze modellen zijn verder ook nuttig om potentiële TAFIa inhibitoren uit te testen en te evalueren voor therapeutisch gebruik. Het gebruik van deze dierenmodellen is echter wel nog ten dele verhinderd door (1) de nog ongekende verschillen in het fibrinolytisch systeem van de verschillende species en (2) de lage crossreactiviteit van de beschikbare antilichamen ter bepaling van humaan TAFI. In het eerste deel van deze studie werden recombinant rat- en muis-TAFI tot expressie gebracht en gekarakteriseerd en vergeleken met humaan TAFI om de verschillen tussen de species op te helderen (cf. chapter 2). Dit bracht aan het licht dat TAFI in deze drie species activeerbaar is door een proteolytische klieving door het trombine-trombomoduline complex na Arg92, resulterend in een actief carboxypeptidase: TAFIa (36 kDa). TAFIa van deze drie species bleek ook een temperatuursafhankelijke instabiliteit te bezitten die belangrijk is voor de downregulatie van TAFIa. Tenslotte werd aangetoond dat TAFIa bij alle species een antifibrinolytisch effect bezit in in vitro klonterafbraak. Deze biochemische karakteristieken zijn cruciaal voor de rol van TAFIa in de fibrinolyse en wijzen op een gelijkaardige functie en regulatie van TAFI(a) in de muis, rat en mens. De werking van plasmine was wel verschillend en wees op Arg147 als primaire klievingplaats in rat-TAFI. De absolute enzymstabiliteit was ook verschillend (bv. rat- en muis-TAFIa zijn significant minder stabiel dan humaan TAFIa) wat resulteert in een kleiner antifibrinolytisch potentieel van muis en rat-TAFIa versus humaan TAFIa (cf. chapter 3). Interessant hierbij is evenwel dat de 50 % klonterafbraak tijden in muis- en ratplasma langer zijn vergeleken met humaan plasma. Rat-TAFIa werd ook gestabiliseerd door de introductie van vier puntmutaties (i.e. S305C-T329I-H333Y-S335Q), wat aanleiding gaf tot een 7,5-voudige stijging van de halfwaardetijd van rat-TAFIa en een 10-voudige verlenging van de 50 %-klonterafbraak. Gelijkaardige mutaties stabiliseerden humaan TAFIa echter 120-voudig, wat erop wijst dat andere regio’s verantwoordelijk zijn voor de stabiliteit in rat-TAFIa versus humaan TAFIa. Deze verschillen in species moeten in rekening gebracht worden bij het extrapoleren van data van rat- en muismodellen naar de mens, zeker bij het evalueren van TAFIa modulatoren. In het tweede deel van deze studie werden in TAFI-deficiënte muizen monoklonale antilichamen (MA’s) gericht tegen rat-TAFI aangemaakt (i.e MA-RT13B2, MA-RT30D8, MA-RT36A3F5, MA-RT36B2 and MA-RT82F12) (cf. chapter 4 and 6). Bepaalde MA’s kunnen gebruikt worden voor de opzuivering van TAFI d.m.v. affiniteitchromatografie (i.e. MA-RT36A3F5) en voor Western blot experimenten (i.e. MA-RT36B2). Verder werden er drie sandwich-type ELISAs (i.e. MA-RT36A3F5/MA-RT30D8-HRP, MA-RT36A3F5/MA-RT82F12-HRP and MA-RT82F12/MART36A3F5-HRP) ( cf. Chapter 3) ontworpen, die gebruikt kunnen worden om rat- en muizen-TAFI in plasma te kwantificeren. Daarmee leveren we als eerste een methode om TAFI in plasma van ratten en muizen te kunnen bepalen. De MA-RT36A3F5/MA-RT82F12-HRP werd reeds toegepast in een studie waarin de rol van TAFI tijdens leverregeneratie werd bestudeerd. Er werd echter geen essentiële rol van TAFI tijdens leverregeneratie vastgesteld. Specifieke inhibitoren van TAFI(a) zouden als adjuvans bij trombolytische therapie gebruikt kunnen worden. Bestaande TAFI inhibitoren zijn vaak niet specifiek genoeg, niet selectief ten opzichte van plasma carboxypeptidase N, of ze vertonen een stabiliserend effect op TAFIa. Monoklonale antilichamen zijn zeer specifieke molecules, die een inhiberend effect kunnen vertonen. Daarom hebben we in het derde deel van deze studie de interactie van de MA’s met de activiteit en de stabiliteit van rat-TAFIa en hun invloed op de klonterafbraak in vitro bestudeerd (cf. chapter 6). Vier MA’s (i.e. MA-RT13B2, MA-RT30D8, MA-RT36A3F5 and MA-RT82F12) vertoonden een profibrinolytisch effect tijdens de klonterafbraak in vitro, waarbij twee verschillende werkingsmechanismen vastgesteld werden: MA-RT13B2 en MA-RT36A3F5 destabiliseren de rat-TAFIa-molecule, MA-RT30D8 en MA-RT82F12 daarentegen blokkeren ofwel de toegang tot het actief centrum ofwel verstoren ze de interactie met de bloedklonter. Verder konden we ook de bindingsplaatsen van de inhiberende MA’s bepalen en daarmee nieuwe moleculaire doelwitten voor de inhibitie van (rat)-TAFIa ophelderen (i.e. Arg227 voor MA-RT13B2, Arg188 en His192 voor MA-RT36A3F5 en Ser249, Ser251, Tyr260 en Arg227 voor MA-RT30D8 and MA-RT82F12, respectievelijk). Samengevat, werden tijdens dit onderzoek species specifieke verschillen tussen TAFI van knaagdieren (i.e. ratten en muizen) en humaan TAFI opgehelderd. Er werden ook tal van tools gegenereerd, die op antilichamen gebaseerd zijn en die gebruikt kunnen worden om TAFI in vivo te bestuderen. Verder beschrijven we MA’s die profibrinolytische eigenschappen vertonen en de functie van (rat)-TAFIa door verschillende werkingsmechanismen inhiberen. Deze MA’s, en mogelijke derivaten ervan, zullen nuttig zijn voor toekomstig TAFI-onderzoek. Tenslotte hebben we nieuwe moleculaire doelwitten voor de directe inhibitie van (rat)-TAFIa opgehelderd. Dit is van belang voor de toekomstige ontwikkeling van inhibitoren van TAFIa voor therapeutische toepassingen. Activated thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFIa) is a regulatory protein of the fibrinolytic system with antifibrinolytic properties. As important link between coagulation and fibrinolysis, it is a potential risk marker for cardiovascular events. On the other hand, inhibition of TAFIa by specific inhibitors is a promising strategy to support thrombolytic treatment. The (patho)-physiological role of TAFI, however, is not entirely understood. Biased analysis techniques to measure human TAFI made it difficult to create a link between TAFI and thrombotic disorders and various clinical studies revealed contradictive outcomes. Rodent models can help to establish a more comprehensive picture of the (patho)physiological role(s) of TAFI(a) in vivo. Furthermore, they are useful to test and evaluate potential TAFIa inhibitors for therapeutic applications. The use of these animal models is still partly hampered by (1) yet unknown species specific differences in the fibrinolytic system and (2) the low cross-reactivity of available immunological agents generated for human proteins. During the first part of this study we expressed and characterized recombinant rat and murine TAFI and compared it to human TAFI to unravel species specific differences (cf. chapter 2). This revealed that TAFI from all three species is activatable through a proteolytic cleavage by thrombin-thrombomodulin after Arg92, generating an active carboxypeptidase: TAFIa (36 kDa). Furthermore, TAFIa from the three species showed a temperature dependent instability which is important for its down-regulation. Finally, TAFIa from all three species showed an antifibrinolytic effect during in vitro clot lysis. These biochemical key characteristics are crucial for the role of TAFIa during fibrinolysis and indicate similar function and regulation of TAFI(a) in rodents and humans. On the other hand, we also unraveled some differences as the interaction with plasmin, which led to the identification of Arg147 as primary cleavage site in rat TAFI. Additionally, the absolute enzyme stability was different (e.g. rat and murine TAFI are significantly less stable than human TAFI) which results in a smaller antifibrinolytic potential of rodent versus human TAFI (cf. chapter 3). Interestingly, however, clot lysis times in rodent plasma are longer compared to human plasma. Moreover, we tried to stabilize rat TAFIa by introducing four single mutations (i.e. S305C-T329I-H333Y-S335Q). This led to an 7,5-fold increase of rat TAFIa half life and a 10-fold increased antifibrinolytic potential. Similar mutations, though, stabilized human TAFIa 120-fold indicating that other regions are responsible for stability in rat TAFIa versus human TAFIa. With respect to in vivo experiments, these species specific differences should be taken into account when extrapolating data from rodent models to humans, especially when evaluating TAFIa modulators. During the second part of this study, monoclonal antibodies (MAs) were raised towards rat TAFI in TAFI deficient mice (i.e MA-RT13B2, MA-RT30D8, MA-RT36A3F5, MA-RT36B2 and MA-RT82F12) (cf. chapter 4 and 6). Selected MAs were suitable for immunological based-techniques as affinity purification (i.e. MA-RT36A3F5) and Western blotting (i.e. MA-RT36B2). Furthermore we established and characterized three sandwich-type ELISAs (i.e. MA-RT36A3F5/MA-RT30D8-HRP, MA-RT36A3F5/MA-RT82F12-HRP and MA-RT82F12/MA-RT36A3F5-HRP) (cf. chapter 3) for the quantification of rat and murine TAFI in plasma. To our knowledge, these are the first fully characterized assays to quantify rodent TAFI. The MA-RT36A3F5/MA-RT82F12-HRP ELISA was used to measure TAFI antigen levels during liver regeneration (cf. chapter 5), but no essential role of TAFI in liver regeneration was observed. The development of specific TAFI(a) inhibitors is a hot topic to support thrombolytic treatment. Currently available inhibitors are either not specific enough, show poor selectivity with respect to plasma carboxypeptidase N or stabilize TAFIa at low concentrations. Monoclonal antibodies are extremely specific molecules with inhibitory potential. Therefore, in the third part of this study, we tested the direct interference of the generated MAs with rat TAFIa activity, rat TAFIa stability and the antifibrinolytic effect of rat TAFIa during in vitro clot lysis (cf. chapter 6). This revealed four inhibitory MAs (i.e. MA-RT13B2, MA-RT30D8, MA-RT36A3F5 and MA-RT82F12). These MAs reduce clot lysis time (up to 98 %) essentially by two different mechanisms: MA-RT13B2 and MA-RT36A3F5 have a destabilizing effect on rat TAFIa whereas MA-RT30D8 and MA-RT82F12 block the access to the active site and/or impair the interaction with the blood clot. Furthermore, we determined the binding sites of the inhibitory MAs to unravel molecular targets for the inhibition of (rat) TAFIa (i.e. Arg227 for MA-RT13B2, Arg188 and His192 for MA-RT36A3F5 and Ser249, Ser251, Tyr260 and Arg227 for MA-RT30D8 and MA-RT82F12, respectively). In summary, during this study species specific differences between rodent and human TAFI have been unraveled. Furthermore numerous antibody-based tools have been developed to facilitate in vivo studies on TAFI. Finally, MAs with profibrinolytic properties have been generated which impair (rat) TAFIa function by entirely new mechanisms. These MAs or their derivatives are promising tools for future TAFI-research. Additionally, we unraveled novel molecular targets for the direct inhibition of (rat) TAFIa and thereby created a starting point for the rational design of TAFIa inhibitors for therapeutic applications.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Inleiding De afronding van het humane genoomproject luidde offcieel een nieuw tijdperk in, dat van het proteoom. Er onstond een nieuwe discipline, proteomics of de analyse van het proteoom, de verzameling van alle eiwitten in een weefsel, cel of organisme op een gegeven ogenblik en onder bepaalde fysiologische omstandigheden. Eiwitten zijn direct verantwoordelijk voor de regulatie van biochemische processen en abberante of ontregelde eiwitexpressie ligt aan de basis van vele ziekten, waaronder kanker. Kennis van kanker gerelateerde eiwitten biedt daarom niet enkel diagnostische perspectieven, het laat ons ook toe om nieuwe moleculen te ontwikkelen die specifiek interageren met de ontregelde eiwitten en zodoende de progressie van de ziekte kunnen remmen. In het lopend onderzoek van het Laboratorium voor Experimentele Oncologie bestonden twee onopgehelderde proteoom vraagstellingen. De eerste vraagstelling was of er kanker specifieke eiwitvarianten bestaan van de Vasculaire Endotheliale Groeifactor A (VEGF-A). VEGF-A speelt een belangrijke rol in de groei, uitzaaiing en resistentie van tumoren, maar is tevens cruciaal voor het onderhoud van een gezond bloedvatenstelsel. Kennis van tumorspecifieke VEGF-A varianten zou mogelijks toelaten om de therapeutische index van anti-VEGF-A therapieën te verbeteren. Een tweede vraagstelling was of Gastrointestinale Stromale Tumoren (GISTs) die snel resistentie ontwikkelen tegen Imatinib systematisch andere eiwitten tot expressie brengen in vergelijking met GISTs waarbij Imatinib resistentie eerder zeldzaam voor komt. Methodologie De belangrijkste uitdagingen voor proteomics zijn de bijzondere proteoomcomplexiteit, de relatief lage eiwit expressieniveaus en de immense inter en intra- individu variabiliteit. Daardoor is er in eerste instantie nood aan een gevoelige en reproduceerbare methodologie, geschikt voor een relatief grote staaldoorvoer. Wij besloten om de bruikbaarheid van ProteinChip technologie voor de studie van bovenvermelde proteomics vraagstellingen na te gaan. ProteinChip technologie maakt gebruik van retentiechromatografische arrays voor het weerhouden van subgroepen van eiwitten uit complexe stalen zoals lichaamsvloeistoffen of weefselextracten. Deze eiwitten worden vervolgens massapectrometrisch geanalyseerd door middel van Surface Enhanced Laser Desorption/ Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (SELDI TOF MS). Resultaten De hoogmoleculaire gewichts varianten van VEGF-A konden geassocieerd worden met verschillende maligniteiten, terwijl de laag moleculaire VEGF-A varianten eerder algemeen bleken voor te komen, ook in normale fysiologische omstandigheden. Een vergelijkende proteoomanalyse bij GISTs wees uit dat 21 SELDI pieken statistisch significant verschilde in intensiteit tussen een groep GISTs met hoge waarschijnlijkheid op Imatinib resistentie en een groep GISTs met laag risico op resistentie ontwikkeling. Een multivariaat statistische analyse wees bovendien uit dat 14 extra SELDI pieken verdere aandacht verdienden. In totaal werden 40 eiwitten geïdentificeerd en de differentiële expressie van een selectie van drie van deze eiwitten kon bevestigd worden door middel van western blot analyse: het 40 kDa ATP-ase domein van Hitte Shock Proteïne 70 (HSP70), Cu/Zn Superoxide. Conclusies en discussie De therapeutische index van anti-VEGF-A therapiën zou mogelijks kunnen verbeterd worden door specifieke inhibitie van de tumor gerelateerde hoog moleculaire gewichts varianten van VEGF-A. Onze gegevens wijzen erop dat de laag moleculaire gewichtsvarianten van VEGF-A een belangrijke rol spelen in normale fysiologie en dus bijgevolg best onaangeroerd blijven om nevenwerkingen te minimaliseren. Stress gerelateerde eiwitten zouden een belangrijke rol kunnen spelen in de ontwikkeling van Imatinib resistentie bij GISTs. Deze eiwitten staan onder centrale controle van de Hitte Shock Factor 1 (HSF1), een eiwit waartegen reeds inhibitoren beschikbaar zijn, hetgeen nieuwe therapeutische perspectieven biedt voor de behandeling van Imatinib resistente GISTs. Ook de inhibitie van de signaaltransductie via de eiwitten 14-3-3 zeta en Calmodulin biedt mogelijks nieuwe therapeutische perspectieven. ProteinChip technologie is zeer geschikt gebleken voor zowel de gerichte analyse van eiwitten als voor de differentiële proteoomanalyse tussen verschillende patiëntengroepen. Introduction The completion of the human genome project officially introduced the era of the proteome. The new discipline of proteomics was born, which refers to the analysis of the proteome or the collection of all proteins that are expressed in a tissue, cell or organism at a given point in time and under certain physiological conditions. Proteins are directly involved in the regulation of biochemical processes and aberrant or deregulated protein expression is related with many diseases, including cancer. Knowledge of cancer related proteins not only offers diagnostic perspectives, but also allows development of new molecules which specifically interact with the deregulated proteins and are thereby able to inhibit cancer progression. Two unanswered proteomic questions existed at the Laboratory of Experimental Oncology. The first question was whether cancer specific variants of the Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A) exist. VEGF-A plays an important role in tumor growth, metastasis and resistance, but is also crucial for the maintenance a healthy vascular system. Knowledge of tumor specific VEGF-A variants might enable us to increase the therapeutic index of anti-VEGF-A therapies. A second proteomic question was whether Gastrointestinal Stromal Tumors (GISTs) that easily develop resistance to treatment with Imatinib express different proteins than GISTs that rarely develop such resistance.  Methods The most important challenges for proteomics are the high complexity of the proteome, the relatively low protein expression levels and the enormous inter and intra individual variability. The most important requirement for proteomic analysis is therefore a sensitive and reproducible method that enables a relatively high sample throughput. We decided to investigate the usefulness of ProteinChip technology for the study of the proteomic questions mentioned above. ProteinChip technology is based on the principle of retention chromatography for the fractionation of proteins from complex samples such as body fluids or tissue extracts. These proteins are subsequently analysed with Surface Enhanced Laser Desorption/ Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (SELDI TOF MS). Results The high molecular weight varieties of VEGF-A were associated with different types of malignancies, while the low molecular weight VEGF-A varieties rather seemed common and were also observed in normal physiological conditions. A comparative proteomic analysis of GISTs pointed out to 21 SELDI peaks that were statistically significantly differentially expressed between a group of GISTs with a high risk for development of Imatinib resistance and a group with a low risk for development of such resistance. Multivariate analysis further pointed out to 14 additional interesting SELDI peaks. In total, forty proteins were identified and the differential expression pattern of a selection of three of these proteins could be confirmed with western blot analysis: the 40 kDa ATP-ase domain of Heat Shock Protein 70 (HSP70), Cu/Zn Superoxide Dismuatase (SOD1) and Protein 14-3-3 Zeta. Conclusions and discussion The therapeutic index of anti-VEGF-A therapies might be improved by specific inhibition of tumor associated high molecular weight VEGF-A varieties. Our data indicate that the low molecular weight varieties of VEGF-A play an important role in normal physiology and should therefore be spared by anti-VEGF-A therapies to minimize the risk of adverse effects. Stress related proteins might play an important role in the development of Imatinib resistance of GISTs. The fact that these proteins are regulated by one and the same factor, the Heat Shock Factor 1 (HSF1), offers interesting perspectives for the treatment of Imatinib resistant GISTs, especially because inhibitors of HSF1 already exist. In addition, the inhibition of signal transduction pathways controlled by 14-3-3 zeta and Calmodulin also seems promising. ProteinChip technology has showed to be suitable for both the targeted analysis of proteins as for the analysis of differential protein expression between different groups of patients. Het genoom of de verzameling van alle genen van een organisme bevat de informatie over hoe alle eiwitten van dat organisme dienen opgebouwd te worden. Het genoom kan men dus beschouwen als het receptenboek van het leven. Onze genen op zich vervullen echter geen enkele functie. De eiwitten beschreven in onze genen daarentegen zorgen voor structuur en biologische activiteit en maken ons uiteindelijk tot wat we zijn. Het doctoraatsonderzoek beschreven in deze thesis startte ongeveer tegelijkertijd met de afronding van het humane genoomproject, waarbij alle menselijke genen werden in kaart gebracht. Deze gebeurtenis staat bekend als een belangrijke mijlpaal in de biomedische geschiedenis, omdat de kennis van het genoom een nodige voorwaarde is om functionele genoomanalyse te kunnen verrichten. Functionele genoomanalyse betekent de studie van de genen die betrokken zijn in biologische en biomedische processen. Door middel van functionele genoomanalyse kunnen we nieuwe inzichten verwerven in onopgeheldere ziekteprocessen zoals kanker. Het proteoom of de verzameling van alle eiwitten van een organisme is als eindprodukt van het genoom het studieonderwerp bij uitstek om inzichten te verwerven in het functionele deel van het genoom. De ontrafeling van het proteoom vereist echter inzet van zogenaamde “state-of-the-art” analytische technieken, die de afgelopen jaren slechts met mondjesmaat ter beschikking zijn gekomen van de wetenschap. Het doel van dit doctoraatsproject was de bruikbaarheid na te gaan van ProteinChip technologie voor de studie van het proteoom van humane tumoren. Daarbij werden verschillende methoden ontwikkeld voor zowel gerichte als “blinde” analyses van eiwitten in tumorweefsels. Deze methoden bleken achteraf ook nuttig te zijn voor de studie van andere biomedische vraagstellingen buiten het domein van de oncologie (bv. ziekte van Alzheimer, endometriose, ...). The genome, or the collection of all genes of an organism contains the information that is required to build all proteins of this organism. The genome may therefore be regarded as the book of recipes of life. Genes do not have any function of their own. The proteins that are encoded by the genome provide structure and are biologically active. The doctoral research described in this thesis started almost simultaneously with the completion of the human genome project, in which all human genes were mapped. This event is regarded as an important milestone in the history of biomedical sciences, because it enables functional genome studies. Functional genome analysis refers to the study of the genes that are involved in biological and biomedical processes. Functional genome analysis enables us to generate new insights into disease processes such as cancer. The proteome or collection of all proteins of an organism is the most appealing subject for functional genome analysis, because it is the end product of the genome. Proteomics refers to the study of the proteome and is by many considered as the most important research strategy in the post-genomic era. Proteomics requires a different approach than genome analysis and above all the use of state-of-the-art technologies such as mass spectrometry. In this doctoral research project, the usefulness of ProteinChip technology was explored for applications in the laboratory of experimental oncology. Several methods were developed for both targeted and blind analysis of proteins in tumor tissues. These methods have already showed to be useful to generate new insights in the molecular biology of cancer and for the development of novel diagnostic tests. ProteinChip technology has also been used successfully to generate new insights in other diseases such as Alzheimer disease and Endometriosis. 

Academic collection --- Theses

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Pleomorphic adenoma gen 1 ( PLAG1 ) codeert voor een transcriptiefactor die betrokken is bij de vorming van verschillende tumoren zoals pleomorfe adenomen van de speekselklier, lipoblastomen, hepatoblastomen en AML. Aangezien PLAG1 blijkbaar een belangrijkere rol speelt bij de ontwikkeling van verschillende types van tumoren dan oorspronkelijk aangenomen, vroegen we ons af wat de oncogene capaciteit is van PLAG1 bij de tumorontwikkeling. Daarom was het doel van deze studie de rol van PLAG1 na te gaan bij de tumorontwikkeling in PLAG1 transgene muizen. Hiervoor werden er twee PLAG1 transgene muizenlijnen ontwikkeld, PTMS1 en PTMS2, waarbij de activatie van de overexpressie van het transgen en de weefseldistributie van deze overexpressie kan gemanipuleerd worden door respectievelijk Cre-gemedieerde activatie en gerichte expressie. In het eerste deel van deze thesis, werd de expressie van het PLAG1 proto-oncogen gericht naar een beperkt aantal weefsels, waaronder de speekselklieren, de borstklieren en de prostaat, door de PLAG1 transgene muizen te kruisen met de MMTV-Cre transgene muis. De resulterende P1-MCre en P2-MCre dubbel transgene muizen, ontwikkelden speekselkliertumoren met een incidentie van respectievelijk 100% na 5-6 weken en 6% na verschillende maanden. De speekselkliertumoren werden gekarakteriseerd als pleomorfe adenomen en ze vertoonden sterke gelijkenissen met de humane tumoren, op enkele details na. Verder ontwikkelden 100% van de 8 weken oude vrouwelijke P1-MCre muizen hyperplasieën van de borstklier, veroorzaakt door adenomyoepithelial adenosis. De borstklier tumorontwikkeling kon niet verder gevolgd worden in P1-MCre muizen, doordat de aanwezigheid van snel ontwikkelende speekselkliertumoren ons niet toeliet de muizen langer in leven te houden omwille van ethische redenen. 16% van de vrouwelijke P2-MCre muizen ontwikkelden adenomyoepitheliomen van de borstklier. Om de ontwikkeling van de borstkliertumoren toch verder te kunnen bestuderen in P1-MCre muizen, hebben we de expressie van het PLAG1 transgen meer specifiek gericht naar de borstklier door de PTMS1 muizen te kruisen met WAP-Cre transgene muizen. Na ongeveer 1 jaar ontwikkelden ongeveer 80% van deze dubbel transgene muizen borstkliertumoren, die hoofdzakelijk gekarakteriseerd werden als adenomyoepitheliomen. Tenslotte ontwikkelden 100% van de 8 weken oude mannelijke P1-MCre muizen intraepitheliale neoplasieën van de prostaat. Op moleculair niveau werden er verschillende genen geïdentificeerd die opgereguleerd zijn in al de PLAG1 -geïnduceerde tumoren, zoals genen van twee onafhankelijke - structureel op elkaar gelijkende - geïmprinte genenclusters ( Igf2 / H19 en Dlk1 / Gtl2 ), genen betrokken in de Igf signaaltransductiecascade, Igf2 , Igfbp2 en Igfbp3, en genen betrokken in de Wnt signaaltransductiecascade, Wnt6 en CyclinD1 . Aangezien de IGF signaaltransductiecascade een belangrijke cascade is in verschillende humane tumoren, zijn we de rol van Igf2 in de tumorvorming verder gaan bestuderen. Hiervoor werd de P1-MCre muis gekruist met de Igf2 knockout muis, om op die manier de impact van de Igf2 inactivatie op de tumorvorming te bestuderen. P1-MCre-Igf2+/+ muizen ontwikkelden twee keer sneller tumoren dan P1-MCre-Igf2 -/- muizen, wat suggereert dat Igf2 inderdaad een belangrijke rol speelt bij de PLAG1 -geinduceerde tumorontwikkeling. Aangezien de ductale en acinaire structuren van een pancreas en een speekselklier veel overeenkomsten vertonen op histologisch niveau en aangezien overexpressie van PLAG1 in de speekselklier aanleiding geeft tot tumorontwikkeling in dit orgaan, vroegen we ons af of overexpressie van PLAG1 in de pancreas al dan niet aanleiding zou geven tot tumorontwikkeling in de pancreas. Om deze hypothese te onderzoeken hebben we de expressie van het PLAG1 transgen gericht naar de pancreas door PTMS1 en PTMS2 muizen te kruisen met Pdx1-Cre transgene muizen. De dubbel transgene nakomelingen, P1-Pdx1Cre en P2-Pdx1Cre muizen, respectievelijk, ontwikkelden geen tumoren, zelfs niet na meer dan 1 jaar, maar ze ontwikkelden wel hyperplasieën van de eilandjes van Langerhans. P1-Pdx1Cre muizen ontwikkelden hypoglycemie, hyperinsulinemie en vertoonden verbeterde glucose tolerantietesten. De insulinesecretie van de eilandjes bleef onveranderd, maar de hyperinsulinemie kan verklaard worden door verhoogde pancreatische insuline waarden. Hoewel Igf2 een belangrijke rol speelt bij de PLAG1 -geïnduceerde tumorontwikkeling, is Igf2 niet belangrijk voor de ontwikkeling van de hyperplasieën van de eilandjes, zoals aangetoond in terugkruisexperimenten met de Igf2 knockout muis. The pleomorphic adenoma gene 1 ( PLAG1 ) encodes a transcription factor that is involved in the development of various tumors such as pleomorphic adenomas of the salivary glands, lipoblastomas, hepatoblastomas and AML. The apparent more general role of the PLAG1 proto-oncogene in tumor development raised the question as to the extent of the oncogenic capacity of PLAG1 . Therefore, the aim of the present study was to explore the role of PLAG1 in neoplastic transformation in PLAG1 transgenic mice. For this objective, two independent PLAG1 transgenic mouse strains were generated, PTMS1 and PTMS2, in which activation of the overexpression of the transgene as well as the tissue distribution of such overexpression can be manipulated by Cre-mediated activation and targeted expression, respectively. In the first part of this thesis, the expression of the PLAG1 proto-oncogene was targeted to a restricted number of tissues, including the salivary glands, the mammary glands and the prostate by intercrossing with MMTV-Cre transgenic mice. The resulting P1-MCre and P2-MCre double transgenic offspring developed salivary gland tumors with an incidence of 100 % at around 5-6 weeks and 6% after several months, respectively. The salivary gland tumors where characterized as pleomorphic adenomas and they closely resemble the human counterpart, despite some differences. Moreover, 100% of the female P1-MCre mice developed mammary gland hyperplasia, caused by adenomyoepithelial adenosis, at the age of 8 weeks. Mammary gland tumorigenesis could not be followed further in P1-MCre mice, because the highly aggressive salivary gland tumor development forced us to sacrifice these mice for ethical reasons at this time point. 16% of the female P2-MCre mice developed adenomyoepitheliomas of the mammary glands. In order to be able to study mammary gland tumorigenesis in mice derived from the PTMS1, we decided to target the expression of the PLAG1 transgene more specifically to the mammary gland by intercrossing those mice with Wap-Cre mice. After a latency period of more than a year about 80% of those mice developed mammary gland tumors, histologically characterized mainly as adenoyoepitheliomas. Finally, 100% of the male P1-MCre mice developed prostatic intraepithelial neoplasias at the age of 8 weeks. At the molecular level, several genes were identified to be upregulated in all the PLAG1-induced tumors studied, such as genes from two independent, structurally somewhat similar imprinted gene clusters ( Igf2/H19 and Dlk1/Gtl2 ), genes involved in Igf signaling, Igf2 , Igfbp2 and Igfbp3 and genes involved in Wnt signaling, Wnt6 and CyclinD1 . Since the IGF system is a key growth regulatory pathway in many tumors, the role of Igf2 on tumor formation was investigated further in P1-MCre mice. Therefore, P1-MCre mice were intercrossed with Igf2 knockout mice, in order to analyze the impact of Igf2 inactivation on tumor formation. P1-MCre-Igf2+/+ mice develop almost twice as fast tumors as compared to P1-MCre-Igf2-/- mice, suggesting that Igf2 indeed plays a significant role in PLAG1 -induced tumorigenesis. Since the ductal and acinar structures of a pancreas and a salivary gland are structurally similar at the histological level and since overexpression of PLAG1 in the salivary glands leads to tumor formation, we wondered whether or not overexpression of PLAG1 in the pancreas would lead to tumor formation in this organ as well. To test this hypothesis, we targeted the expression of the PLAG1 transgene to the pancreas by intercrossing of the PTMS1 and PTMS2 with Pdx1-Cre transgenic mice. The double transgenic offspring mice, P1-Pdx1Cre and P2-Pdx1Cre mice, respectively, did not develop any tumors, even not in mice from more than a year, but they developed hyperplasia of the islets of Langerhans. P1-Pdx1Cre mice developed hypoglycaemia, hyperinsulinaemia and showed improved glucose tolerance tests. The insulin secretion from the islets was conserved but significantly increased pancreatic insulin content levels could explain the observed hyperinsulinemia. At the molecular level, Igf2 , although important for PLAG1 -induced tumorigenesis, is not important for the observed islet hyperplasia as deduced from intercrossing with Igf2 knockout mice. Pleomorphic adenoma gen 1 ( PLAG1 ) is een gen dat betrokken is bij de vorming van verschillende tumoren zoals, tumoren van de speekselklier, vetweefsel, lever en leukemie. Aangezien PLAG1 blijkbaar een belangrijkere rol speelt bij de ontwikkeling van verschillende types van tumoren dan oorspronkelijk aangenomen, vroegen we ons af wat de rol is van PLAG1 bij de tumorontwikkeling. Daarom was het doel van deze studie deze rol na te gaan in genetisch gemanipuleerde muizen ( PLAG1 transgene muizen). Hiervoor werden er twee muizenlijnen ontwikkeld, PTMS1 en PTMS2, waarbij de activatie van de overexpressie van PLAG1 en de weefseldistributie van deze overexpressie kan gemanipuleerd worden door de muizen te kruisen met verschillende andere genetisch gemanipuleerde muizen (Cre muizen, in deze studie MMTV-Cre , WAP-Cre en Pdx1-Cre ). In het eerste deel van mijn thesis, werd de expressie van PLAG1 gericht naar een beperkt aantal weefsels, waaronder de speekselklieren, de borstklieren en de prostaat, door muizen van de twee verschillende PLAG1 transgene muizen stammen te kruisen met MMTV-Cre muizen. De nakomelingen van de ene PLAG1 transgene muizenstam (P1-MCre), ontwikkelden speekselkliertumoren met een incidentie van 100% na 5-6 weken en die van de andere stam (P2-MCre) met een incidentie van 6% na verschillende maanden. De speekselkliertumoren werden gekarakteriseerd als pleomorfe adenomen (een bepaald type speekselkliertumor) en ze vertoonden sterke gelijkenissen met humane pleomorfe speekselklieradenomen, op enkele details na. Verder ontwikkelden 100% van 8 weken oude vrouwelijke P1-MCre muizen hyperplasieën (vergrotingen) van de borstklier. De borstklier tumorontwikkeling kon niet verder gevolgd worden in P1-MCre muizen, doordat de aanwezigheid van snel ontwikkelende speekselkliertumoren ons niet toeliet de muizen langer in leven te houden omwille van ethische redenen. 16% van de vrouwelijke P2-MCre muizen ontwikkelden adenomyoepitheliomen (een bepaald type borstkliertumor). Om de ontwikkeling van de borstkliertumoren toch verder te kunnen bestuderen in P1-MCre muizen, hebben we de expressie van het PLAG1 transgen meer specifiek gericht naar de borstklier door de PTMS1 muizen in te kruisen met WAP-Cre transgene muizen. Na ongeveer 1 jaar ontwikkelden ongeveer 80% van deze nakomelingen borstkliertumoren, die hoofdzakelijk gekarakteriseerd werden als adenomyoepitheliomen. Tenslotte ontwikkelden 100% van 8 weken oude mannelijke P1-MCre muizen intraepitheliale neoplasieën van de prostaat (een voorstadium van een prostaattumor). Op moleculair niveau werden er verschillende genen geïdentificeerd die opgereguleerd zijn in alle PLAG1 -geïnduceerde tumoren. Deze genen liggen hoofdzakelijk in twee signaaltransductiecascades, de Igf en de Wnt cascade. Aangezien de IGF signaaltransductiecascade ook een belangrijke cascade is in verschillende humane tumoren, zijn we de rol van Igf2 in de tumorvorming verder gaan bestuderen door middel van genetische experimenten in muizen. Als we dit Igf2 gen uitschakelen in ons muizen tumormodel ontstaan de tumoren veel later, waardoor het belang van Igf2 bij de tumorontwikkeling is aangetoond. In het laatste deel van mijn thesis vroegen we ons af of overexpressie van PLAG1 in de pancreas al dan niet aanleiding zou kunnen geven tot tumorontwikkeling in de pancreas. Om deze hypothese te onderzoeken hebben we de expressie van PLAG1 gericht naar de pancreas door PTMS1 en PTMS2 muizen te kruisen met Pdx1-Cre transgene muizen. De dubbel transgene nakomelingen, P1-Pdx1Cre en P2-Pdx1Cre muizen, respectievelijk, ontwikkelden geen tumoren, zelfs niet na meer dan 1 jaar, maar ze ontwikkelden wel hyperplasieën (vergroting) van de eilandjes van Langerhans. P1-Pdx1Cre muizen hebben lagere glucosespiegels en hogere insulinespiegels in het bloed. De hogere insulinespiegels in het bloed kunnen verklaard worden doordat er een toename is aan insuline producerende cellen in de eilandjes van Langerhans. Hoewel Igf2 een belangrijke rol speelt bij de PLAG1 -geïnduceerde tumorontwikkeling, is Igf2 niet belangrijk voor de ontwikkeling van de hyperplasieën van de eilandjes van Langerhans, zoals aangetoond met behulp van genetische experimenten.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

De zuurstofstijging in de atmosfeer van de aarde veroorzaakte een snelle diversificatie en uitbreiding van levende diersoorten, die complexe biochemische netwerken ontwikkelden om te voldoen in hun vraag naar energie. Zuurstof is belangrijk voor het overleven van multicellulaire organismen wegens zijn rol als elektron-acceptor tijdens mitochondriale ademhaling (aëroob). Nochtans kunnen vele diersoorten in omstandigheden van lage zuurstof-beschikbaarheid (hypoxie) overleven. Aanpassing aan hypoxie, zoals reeds beschreven werd voor dieren die duiken en organismen die op hoge hoogten leven, vereist een sterke vermindering van cellulaire zuurstofconsumptie. Hypoxie tolerante dieren zijn geëvolueerd om aan beperkte zuurstofhoeveelheid het hoofd te kunnen bieden, wat hen toelaat te overleven in dergelijke omstandigheden. Deze aanpassing impliceert een verschuiving in cellulair brandstofgebruik van mitochondriale ademhaling (aëroob), wat zuurstof verbruikt, naar het aanmaken van ATP buiten het mitochondrion door glucose te verbranden, zonder zuurstof te verbruiken (anaërobe glycolyse). Hypoxie induceerbare transcriptiefactoren (HIFs) spelen een rol in deze cellulaire aanpassing door de expressie van genen te verhogen die betrokken zijn bij de fysiologische aanpassing aan lage zuurstofhoeveelheid (genen betrokken bij angiogenese, erythropoïese, energie-metabolisme, celgroei en apoptose). HIF prolylhydroxylases (PHD1-3) zijn zuurstofsensoren, die, via hydroxylation van specifieke proline residu's in HIF, de stabiliteit en zodoende de transcriptionele reacties van HIF reguleren. De mechanismen waarmee hypoxie een vermindering van mitochondriale zuurstofconsumptie teweegbrengt zijn echter nog niet volledig ontrafeld. Hypoxie is een altijd aanwezige bedreiging voor het "zoogdierkoninkrijk" en is geassocieerd met alle vormen van ischemische vasculaire ziekten, zoals hart- en bloedvatziekten met inbegrip van hartinfarct, hartverlamming, myocardiale en ledemaat ischemie. Uitgesproken hypoxie wordt ook gezien in het kerngebied van tumors waar capillaire netwerken onvoldoende georganiseerd zijn om het snel groeiende weefsel van voldoende zuurstof te voorzien. Voorafgaande aan deze doctorale thesis, bleven de verschillende functies van elk van de PHDs in vivo, in gezondheid en ziekte, grotendeels onbekend. Wij stelden de hypothese dat PHDs diverse aspecten, met betrekking tot de HIF signaalwegen en cellulaire hypoxie, in vivo reguleren. Om de rol van Phd1 te bestuderen, werden transgene muizen (Phd1-/-) gegenereerd die specifiek het Phd1 gen niet langer tot expressie brengen. Deze werden onderworpen aan muismodellen van ischemie/reperfusie (I/R) wat verscheidene nieuwe, intrigerende, en therapeutisch relevante observaties opleverde. Afsluiting van de dijslagader, en zodoende het blokkeren van voldoende zuurstoftoevoer leidt in wild type dieren tot snelle afsterving van de desbetreffende spieren. Wij ontdekten dat deze spierdood in dieren die de zuurstofsensor Phd1 missen, verrassend genoeg niet optrad. Dit was niet te wijten aan een verbeterde toevoer van bloed of zuurstof (zoals oorspronkelijk geanticipeerd werd), maar bleek gerelateerd aan een spier intrinsieke metabole aanpassing. Deze nieuwe bevinding bracht aan het licht dat Phd1 een specifieke rol heeft in hypoxie tolerantie in spieren. De observatie dat de afwezigheid van Phd1 (Phd1-/-), maar niet Phd2 (Phd2+/-) of Phd3 (Phd3-/-), selectief hypoxie-tolerantie induceert, toonde aan dat, hoewel alle PHDs in myofibers tot expressie komen, elke PHD een specifieke fysiologische rol in vivo heeft. Onze studies om de mechanismen waarmee Phd1 bescherming tegen ischemische aandoeningen biedt te verduidelijken, onthulden een moleculaire ‘trigger’ die een cascade aan gebeurtenissen in werking stelt om zo de cellulaire zuurstofvereisten te herprogrammeren. Onze genetische studie wijst aan dat Phd1, als zuurstofsensor, een belangrijke rol heeft in de metabole herprogrammering noodzakelijk voor verminderde zuurstofconsumptie door de spier. Dit zuurstofbehoud is toe te schrijven aan een selectieve daling in glucose oxidatie, zonder veranderingen in de vetverbranding. De cellulaire aanpassing aan hypoxie impliceerde een verminderde mitochondriale ademhaling samen met een stijging in anaërobe glycolyse, dit om de ATP productie op peil te houden, een metabole aanpassingsreactie die het Pasteur effect wordt genoemd. Bovendien toonden wij aan dat afwezigheid van Phd1 niet alleen hypoxie-tolerantie induceert - aangetoond door verminderde spiernecrose – maar ook de concentratie aan nadelige reactieve zuurstofdeeltjes (ROS) en zo mitochondriale schade vermindert. De snelheid waarmee deze bescherming na de bloedtoevoerblokkering reeds voorkwam, impliceerde een herprogrammering van het basismetabolisme, dat Phd1-/- muizen "voorbereidde" om beter het hoofd te bieden aan acute ischemische schade. Studies om de downstream moleculen van Phd1 (die bescherming bieden tegen oxidatieve afsterving in ischemie) te ontrafelen toonden aan dat afwezigheid van Phd1 de expressie van Hif-2α, maar niet van het goed bestudeerde Hif-1α, in de kuitspier verhoogt. Stijging van Hif-2α was geassocieerd met een verhoogde Pyruvaat dehydrogenase kinase 4 (Pdk4) expressie, een negatieve regulator van het Pyruvaat dehydrogenase complex (PDC), wat werkzaam is als 'portier' voor de aanvoer van glucose-afgeleide pyruvaat in het mitochondrion. Wij merkten ook op dat afwezigheid van Phd1 de expressie van Pparα (Peroxisoom-proliferatie-activerend receptor-α), een reeds welgekende regulator van Pdk4 gentranscriptie, verhoogt. Daarenboven veroorzaakte behandeling van wild-type muizen met de Pparα agonist ‘fenofibrate’ hypoxie-tolerantie, en onderdrukking van Pparα in spieren van Phd1-/- muizen deed het hypoxie-tolerantie fenotype van mutante muizen teniet. Globaal genomen, wijzen onze bevindingen op een regulerende signaalweg teweeggebracht door een verminderde Phd1 activiteit, die leidt tot verhoogde Hif-2α concentraties en inductie van een Pparα-Pdk4 gemedieerde blokkade aan substraat afkomstig van glucose in het mitochondrion, waardoor zuurstofconsumptie wordt verminderd. Het inzicht dat Phd1 hypoxie-tolerantie en reacties op oxidatieve stress controleert, zette ons ertoe aan om het therapeutische nut van Phd1-inhibitie te bekijken. Onze in vivo studies, waarin Phd1 expressie onderdrukt werd door gebruik te maken van short hairpin interfererende Phd1 constructen (shPhd1) die via in vivo electroporatie toegediend werden, toonden verminderde weefselschade aan in een muismodel van ligatie van de femorale arterie. femoral artery ligatie. Verder onderzoek zal aantonen of het zinvol is om de cellulaire hypoxische reactie als doelstelling te kiezen voor therapieën gericht op hart- en bloedvatziekten (stimulatie van hypoxische tolerantie) en kanker (preventie van hypoxische tolerantie). Tot slot biedt dit onderzoeksproject nieuwe inzichten in mechanismen betrokken bij het herprogrammeren van cellulaire metabole aanpassingen die gekend zijn om te ontstaan in omstandigheden van lage zuurstofbeschikbaarheid zoals in cardiovasculaire ziekten. Studies in de toekomst zullen noodzakelijk zijn om het raadsel van het onderliggende moleculaire mechanisme verder aan te vullen en te bepalen of deze weg een mogelijk therapeutisch doel vertegenwoordigt. Induceren van hypoxie tolerantie zou een belangrijke therapeutische waarde kunnen hebben om orgaanbehoud voor transplantaties te verbeteren en farmacologische inhibitie van PHD1 zou een bruikbare methode kunnen vormen om organen beter tegen ischemische beschadiging te beschermen. The increase of oxygen in the earth's atmosphere prompted a rapid diversification and expansion of living species, which developed complex biochemical networks in order to meet the demand for energy. Oxygen is critical for the survival of multicellular organisms because of its role as an electron acceptor during mitochondrial respiration. However, many species are able to survive in conditions of low oxygen availability (hypoxia). Adaptation to hypoxia, as described for diving animals and organisms that live at high altitudes, requires a dramatic reduction in cellular oxygen consumption. Hypoxia tolerant animals have evolved to cope with limited oxygen supply allowing them to survive in such conditions. This response involves a shift in cellular fuel utilization from mitochondrial respiration, which consumes oxygen, to the generation of ATP outside of the mitochondrion by burning glucose without the use of oxygen (anaerobic glycolysis). HIFs have been shown to play a part in this cellular adaptation by increasing the expression of genes encoding proteins involved in anaerobic glycolysis. However, the mechanisms whereby hypoxia triggers a reduction in mitochondrial oxygen consumption have not been completely unravelled. Hypoxia is an ever-present threat for the “mammalian kingdom” and is associated with all forms of ischemic vascular disorders, such as arterial diseases including stroke, myocardial and limb ischemia. Severe hypoxia is also found in the core region of tumours where capillary networks are insufficiently organized to supply the rapidly growing tissue with oxygen. Aerobic organisms are equipped with mechanisms to sense changes in oxygen tension. The HIF prolyl hydroxylases (PHD1-3) are oxygen sensitive enzymes, which, by catalyzing the hydroxylation of specific proline residues, regulate the stability of HIFs and thereby induce cellular adaptations in response to hypoxia. However, although major progress has been made in understanding the molecular mechanisms by which PHDs regulate oxygen homeostasis, the extent to which these different PHD isoforms may differentially contribute to specific pathophysiological processes in vivo has not yet been addressed. Prior to the start of this thesis, the distinct in vivo functions of each of the PHDs, in health and disease, remained largely unknown. We hypothesized that PHDs orchestrate various aspects related to HIF signaling pathways in vivo. In order to study the role of Phd1, transgenic mice (Phd1-/-) were generated specifically lacking Phd1 gene expression. Mouse models of I/R were utilized and resulted in several novel, intriguing, and therapeutically relevant observations. We demonstrated that Phd1 has a specific role in hypoxia tolerance in skeletal muscle. The finding that loss of Phd1 (Phd1-/-), but not Phd2 (Phd2+/-) or Phd3 (Phd3-/-), selectively induced hypoxia tolerance, revealed that, even though all PHDs are expressed in myofibers, each has specific physiological roles in vivo. Studies to elucidate the mechanisms by which Phd1 provide protection against ischemic insult, unveiled a molecular trigger that initiates a cascade of events to reprogram cellular oxygen requirements. Our genetic study provides evidence that Phd1, which acts as an oxygen sensor, plays a key role in the metabolic reprogramming necessary for reducing muscle oxygen consumption. This oxygen conservation is attributable to a selective decrease in glucose oxidation, without alterations in fat combustion. Cellular adaptation to hypoxia involves a reduction in mitochondrial respiration accompanied by an increase in anaerobic glycolysis in order to maintain ATP production, an adaptive metabolic response termed the Pasteur effect. In addition, we demonstrated that loss of Phd1 induces hypoxia tolerance to the effects of reduced blood supply in skeletal muscle, as evidenced by reduced muscle necrosis, lower concentrations of injurious reactive oxygen species (ROS) and thus reduced mitochondrial damage compared to normal mice. The rapidity with which this protection occurred implied a reprogrammed basal metabolism, which “prepared” Phd1-/- mice to cope better with acute ischemic insults. Studies to elucidate which molecules are downstream targets of Phd1 providing protection against oxidative death in ischemia, revealed that loss of Phd1 increases concentrations of HIF-2α, but not of the well-studied HIF-1α, in skeletal muscle. Induction of HIF-2α was associated with an increase in the expression of Pdk4, a negative regulator of the PDH complex (PDC), which acts as the ‘gatekeeper’ for entry of glucose-derived pyruvate into the mitochondrion. We also observed that loss of Phd1 increases the expression of Pparα, a well-established regulator of Pdk4 gene transcription. Moreover, treatment of wild-type mice with the Pparα agonist fenofibrate induced hypoxia tolerance and ‘knockdown’ of Pparα in muscle of Phd1-/- mice abolished the hypoxia-tolerant phenotype of the mutant mice. Taken together, our findings supports the existence of a regulatory pathway that is triggered by reduced activity of Phd1, leading to increased HIF-2α concentrations and induction of a Pparα-Pdk4 mediated block in the entry of glucose-derived substrate into the mitochondrion, thereby reducing oxygen consumption. The finding that Phd1 controls hypoxia tolerance and responses to oxidative stress prompted us to consider the therapeutic utility of Phd1-inhibition. Indeed, our in vivo studies in which Phd1 was silenced via administration of short hairpin interference Phd1 constructs (shPhd1) by in vivo electroporation, resulted in reduced tissue damage in a murine model of femoral artery ligation. Further investigations will validate whether targeting the cellular hypoxic response makes sense for therapies aimed at cancer (prevention of hypoxic tolerance) and cardiovascular disease (stimulation of hypoxic tolerance). Finally, this work provides new insights into the mechanisms involved in the adaptive reprogramming of cellular metabolism known to occur in conditions of low oxygen availability. Future studies will be necessary to complete the puzzle of the underlying molecular mechanism and to determine whether this pathway represents a valid therapeutic target. Induction of hypoxia tolerance might be of therapeutic value to improve organ preservation for transplantation and pharmacological inhibition of PHD1 may provide a useful means to protect organs from ischemic injury. Implicaties voor nieuwe therapeutische toepassingen in diverse ziekten (zoals hart- en bloedvatziekten) gekenmerkt door gebrek aan zuurstof of oxidatieve stress Onvoldoende of verstoorde zuurstoftoevoer (hypoxie) is een zeer belangrijk stimulus voor angiogenese en speelt een significante rol in de pathofysiologie van ischemische hart- en bloedvatziekten (myocardiale infarcten en trombose) en talrijk andere ziekten. Myocardiale ischemie, zoals optreedt na occlusie van een coronair arterie, diabetisch hartfalen, blootstelling aan grote hoogte of anemie leidt tot moeilijk behandelbaar hartfalen. Het hart is een orgaan met een bijzonder grote gevoeligheid voor hypoxie aangezien het hart slechts beperkte reserves heeft van hoog energetische fosfaten in combinatie met een zeer hoog metabolisme en hoge ATP omzetting. Zowel hypoxie als oxidatieve stress resulteren in biochemische en functionele veranderingen wanneer een orgaan poogt zijn functie te behouden ten overstaan van verstoringen in zuurstofspanning. Wanneer cellen uitgedaagd worden door hypoxie, verhogen ze de expressie van genen die betrokken zijn bij de fysiologische aanpassing aan lage zuurstofhoeveelheid (genen betrokken bij angiogenese, erythropoïese, energie-metabolisme, celgroei en apoptose). Deze compensatoire reactie op hypoxie is grotendeels afhankelijk van de activering van een familie van hypoxie induceerbare factoren (HIF). HIFs zijn heterodimeren die gevormd worden door HIF-1α (of zijn homoloog HIF-2α) en een constitutief tot expressie komende HIF-ß subeenheid (HIF-ß/ARNT) die binden aan hypoxie respons elementen (HRE) in hypoxie-gereguleerde genen. HIF prolylhydroxylases (PHD1-3) zijn zuurstofsensoren, die, via hydroxylation van specifieke proline residu's in HIF, de stabiliteit en zodoende de transcriptionele reacties van HIF bij normoxie reguleren. Tot nu toe zijn de verschillende functies van elk van de PHDs, in gezondheid en ziekte (in vivo), echter grotendeels onbekend, en is het onbekend of en welke HIFs downstream targets zijn van de PHDs. Ten slotte is het tot heden onopgehelderd of PHDs een specifieke functie vervullen in verschillende organen, zoals bijvoorbeeld in het hart, zowel in gezonde als pathologische omstandigheden. Ondanks de belangrijke vooruitgang in het begrijpen van de moleculaire regulatie mechanismen waarmee PHDs functioneren, blijven vele vragen onbeantwoord. In het bijzonder, voorafgaand aan onze studies, bleven de functie en de specifieke rol van Phd1 in vivo een mysterie. Doch, het feit dat PHDs cellulaire reacties reguleren in situaties van lage zuurstofbeschikbaarheid, suggereert dat zij een rol kunnen spelen in verscheidene fysiologische en pathofysiologische processen. Wij stelden de hypothese dat PHDs, via HIF, een essentiële rol spelen in de regulatie van cellulaire reacties op hypoxie in vivo. Bovendien, stelden wij voorop dat manipulatie van de PHD/HIF weg zou kunnen leiden tot therapeutische toepassingen in een brede waaier van ziekten waarin hypoxie een rol speelt in de ontwikkeling of genezing van ziekte. De PHD/HIF weg kan bijvoorbeeld een aantrekkelijk therapeutisch doel vormen in ischemische ziekte, waar bevordering van HIF-1- afhankelijke aanpassing met farmacologische hydroxylase inhibitoren weefseloverleving zou verbeteren. Of omgekeerd, in een groeiende tumor die hypoxisch wordt - omdat die de lokale bloedtoevoer ontgroeit –gebruik maakt van de HIF signaalweg om tumorontwikkeling te vergemakkelijken, zouden klein-molecule inhibitoren van de HIF-activiteit een therapeutisch voordeel kunnen bieden in de behandeling van kanker. Tot slot biedt dit onderzoeksproject nieuwe inzichten in mechanismen betrokken bij het herprogrammeren van cellulaire metabole aanpassingen die gekend zijn om te ontstaan in omstandigheden van lage zuurstofbeschikbaarheid zoals in bijvoorbeeld cardiovasculaire ziekten.