Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Rhizobium etli is een Gram-negatieve bodembacterie die in staat is om stikstof te fixeren tijdens symbiose met zijn gastheerplant Phaseolus vulgaris. Gedurende deze symbiose koloniseren rhizobia de wortels van hun gastheerplant waarbij ze de ontwikkeling van gespecialiseerde organen, wortelknolletjes genaamd, induceren. Binnen deze knolletjes differentiëren de bacteriën tot bacteroïden die gefixeerde stikstof leveren aan de gastheerplant in ruil voor koolstofbronnen. Een efficiënte symbiose vereist een extensieve moleculaire communicatie tussen plant en bacterie. Hoewel al veel onderzoek gewijd werd aan de initiële stappen van deze interactie, is er weinig geweten over de signalen die belangrijk zijn tijdens de latere stappen van de symbiose. Tijdens een genoomwijde screening voor nieuwe symbiotische genen in R. etli CNPAF512, werd een mutant in een vermeende oligopeptide ATP-bindingscassette (ABC) transporter geïdentificeerd. Deze mutant vertoonde in vergelijking met wildtype R. etli een significante reductie in stikstoffixatiecapaciteit, hetgeen een mogelijke rol voor peptidentransport tijdens symbiose suggereert. Deze studie had als doel de rhizobiële oligopeptide ABC-transporter te karakteriseren en, specifiek, zijn rol gedurende de symbiose met de gastheerplant P. vulgaris te onderzoeken. Oligopeptide ABC-transporters zijn transmembranaire multidomein transporters, betrokken bij de opname van oligopeptiden in de cel. De primaire en best gekende functie van dergelijke oligopeptidentransportsystemen in Gram-negatieve bacteriën is nutritioneel. De opname van kleine peptiden als nutriënt en het recycleren van celwandpeptiden voorzien de cel van energie en stikstofbronnen. Naast deze opname van nutriënten hebben de peptidentransporters ook nog andere functies zoals chemotaxis, chaperone-activiteit, de opname van heem, en osmoprotectie. Bovendien werd geopperd dat Gram-negatieve bacteriën, zoals reeds werd vastgesteld voor Gram-positieve bacteriën, gebruik maken van oligopeptide ABC-transporters om de locale omgevingscondities te registreren via binding en/of translocatie van signaalpeptiden. Duidelijk bewijs voor deze signaalfunctie ontbreekt vooralsnog. Tijdens deze studie werd de sequentie van de oligopeptide ABC-transporter (Opt) locus van R. etli CNPAF512 bepaald. Deze locus bevat acht genen, namelijk vier genen coderend voor de vier subeenheden van een oligopeptide ABC-transporter (Opt), een adenylaat cyclase gen ( cyaA) , twee genen homoloog aan redA (een vermeend glycosyltransferase) , en een redB gen (een vermeend glycosyltransferase). De vier subeenheden van de Opt-transporter omvatten een periplasmatisch substraatbindingseiwit (OptA), twee transmembranaire permease-eenheden (OptB en OptC) en een ATP-bindingseiwit dat twee ATPase-domeinen bevat (OptD). De vier genen die coderen voor deze vier subeenheden vertonen gelijkenis met gekende genen coderend voor oligopeptide, dipeptide en murein peptide ABC-transporters. Om de R. etli opt genen te karakteriseren, werden een aantal opt mutanten geconstrueerd en geëvalueerd, zowel in planta als tijdens vrijlevende condities. Planten geïnoculeerd met R. etli opt mutanten vertoonden een verminderde symbiotische stikstoffixatie-activiteit (reductie van ongeveer 50 %). Groeitesten uitgevoerd op opt mutanten in aanwezigheid van oligopeptiden als enige stikstofbron bevestigden dat de opt genen betrokken zijn bij de opname van oligopeptiden. Een verdere fenotypering van de opt mutanten maakte duidelijk dat zij ook een verhoogde resistentie vertonen tegen het oligopeptide antibioticum bacitracin, een verhoogde gevoeligheid vertonen voor het β-lactam antibioticum ampicilline en een verminderde osmotolerantie hebben. Dit toont aan dat het opt operon in R. etli van belang is voor resistentie tegen bepaalde vormen van stress. Een transcriptionele studie van de opt regio werd ook uitgevoerd. Via RT-PCR werd aangetoond dat de acht genen van de opt locus deel uitmaken van één transcriptionele eenheid. Door de constructie van gusA -reportergen fusies werd het expressiepatroon van drie mogelijke promoterregio's van het opt operon onderzocht. Alle drie de fusieconstructen vertoonden promoteractiviteit, zowel onder vrijlevende als symbiotische condities. Bovendien werd aangetoond dat de expressieniveaus afhankelijk zijn van de groeifase waarin de bacterie zich bevindt. Daarenboven werd het expressieniveau van één van de drie constructen significant geïnduceerd in complexe groeimedia. Aangezien oligopeptide ABC-transporters in verband worden gebracht met celwandrecyclage en met vele processen die mogelijk beïnvloed worden door modificaties in de structuur van peptidoglycaan, is de R. etli Opt transporter mogelijk betrokken bij het wijzigen van de celwandstructuur. In een preliminaire studie werd de structuur van R. etli peptidoglycaan geanalyseerd via LC-MS/MS. De data resulterend uit deze MS/MS analyse van R. etli muropeptiden bevestigen dat de peptidoglycaanstructuur van R. etli lijkt op de archetypische peptidoglycaanstructuur van Gram-negatieve bacteriën, nl. NAG-NAM-L-Ala-D-Glu-(γ)- m -Dap-D-Ala, en dat zowel m- Dap-D-Ala en m- Dap- m- Dap kruisverbindingen aanwezig zijn. Rhizobium etli is a Gram-negative root-colonizing soil bacterium capable of fixing nitrogen while living in symbiosis with its leguminous host Phaseolus vulgaris . During this symbiosis, rhizobia colonize the roots of their host, inducing the development of specialized organs, called root nodules. Inside these nodules differentiated bacteria, called bacteroids, exchange fixed nitrogen with the host in return for carbon compounds. An efficient symbiosis requires an extensive molecular communication between plant and bacteria. Although a lot of research has been devoted to the initial steps of the interaction, little is known about the signals which are important during the late steps of the symbiosis. In a genome-wide screening for novel symbiotic genes in R. etli CNPAF512, a mutant affected in a gene encoding a putative oligopeptide ATP-binding cassette (ABC) transporter was identified. This mutant showed a significant reduction in nitrogen fixation capacity compared to wild-type R. etli, suggesting a possible role for peptide transport during symbiosis. The goal of this study was to characterize this rhizobial oligopeptide ABC-transporter (Opt) and specifically investigate its role during symbiotic interactions with its host plant P. vulgaris (common bean). Oligopeptide ABC-transporters are multidomain transmembrane translocators involved in the uptake of oligopeptides into the cell. The primary and best known function of these oligopeptide transport systems in Gram-negative bacteria is nutritional. The uptake of small peptides as a nutrient and the recycling of cell wall peptides provide the cell with energy and nitrogen sources. Besides the mere uptake of nutrients, these peptide transporters have been ascribed additional functions like chemotaxis, chaperoning, heme uptake, and osmoprotection. Moreover, it has been suggested that Gram-negative bacteria, as has been established for Gram-positive bacteria, use oligopeptide ABC-transporters to sense local environmental conditions by binding and/or translocating signalling peptides, although clear evidence of this signalling function is still lacking. In this study, the opt locus of R. etli CNPAF512 was cloned and sequenced, revealing a R. etli genomic region containing eight genes: four genes encoding the four subunits of an oligopeptide ABC-transporter (Opt), an adenylyl cyclase gene ( cyaA), two redA homologous genes (putative glycosyltransferases), and one redB gene (a putative glycosyltransferase). The four subunits of the Opt-transporter include one periplasmic substrate-binding protein (OptA), two transmembrane permease subunits (OptB and OptC) and an ATP-binding protein, containing two ATPase domains (OptD). The four opt genes encoding these subunits resemble known genes encoding oligopeptide, dipeptide and murein peptide ABC-transporters. To functionally characterize the R. etli opt genes, several opt mutants were constructed and evaluated in planta and under free-living conditions. Plants nodulated by R. etli opt mutants showed a reduced symbiotic nitrogen fixation activity (approximately 50 % reduction). Growth experiments with opt mutants in the presence of oligopeptides as the sole nitrogen source confirmed the involvement of the opt genes in oligopeptide uptake. Further phenotypic analysis of the opt mutants revealed an enhanced resistance to the oligopeptide antibiotic bacitracin, an increased susceptibility to the β-lactam antibiotic ampicillin and a decreased osmotolerance, demonstrating a contribution of the opt operon to stress resistance in R. etli. A transcriptional study of the opt region was also performed. Using RT-PCR the eight genes of the opt locus were demonstrated to be part of one transcriptional unit. By constructing gusA reporter gene fusions, three putative promoter regions of the opt operon were evaluated for their expression patterns. All three fusion constructs were shown to possess promoter activity in both free-living and symbiotic conditions. Moreover, expression levels were demonstrated to be growth phase-dependent. In addition, the expression level of only one of the three constructs was significantly induced in complex growth media. Since oligopeptide ABC-transporters have been linked to cell wall recycling and to many processes which might be influenced by changes in peptidoglycan structure, the R. etli Opt transporter could be involved in modifying cell wall structure. In a preliminary study the structure of R. etli peptidoglycan was analysed using LC-MS/MS. Data resulting from this MS/MS analyses of muropeptide preparations of R. etli confirm that the peptidoglycan structure of this bacterium is similar to the archetypal peptidoglycan structure of Gram-negative bacteria, being NAG-NAM-L-Ala-D-Glu-(γ)- m -Dap-D-Ala, and that both m- Dap-D-Ala and m- Dap- m- Dap cross-linkages are present in R. etli peptidoglycan. Vlinderbloemige planten, en vooral de gewone boon (Phaseolus vulgaris), zijn belangrijke gewassen aangezien ze o.a. de belangrijkste bron van eiwitten vormen in de menselijke voeding in Afrika en Latijns-Amerika. Rhizobium etli is een bodembacterie die in staat is om knolletjes te vormen op de wortels van zijn gastheerplant Phaseolus vulgaris. Binnenin deze knolletjes vormt de bacterie atmosferische stikstof (N2) om tot ammonium wat als stikstofbron gebruikt kan worden door de plant. Dit proces wordt biologische stikstoffixatie genoemd en vormt een belangrijk voordeel voor de plant aangezien stikstof, na water en koolstofdioxide, het belangrijkste nutriënt is voor planten. Bovendien vormt stikstof vaak de limiterende factor in de groei van de plant. Planten zijn immers niet in staat om zelf atmosferische stikstof te gebruiken. Ook de bacterie Rhizobium etli haalt echter voordeel uit de interactie met de boon: in ruil voor de stikstof levert de plant koolstofbronnen aan de bacterie. Omdat beide partners voordeel halen uit deze interactie wordt ze ook symbiose genoemd. Aangezien een goede biologische stikstoffixatie de opbrengst van vlinderbloemige gewassen kan verhogen en bovendien kan bijdragen tot duurzame landbouw vormt de symbiose tussen Rhizobium etli en Phaseolus vulgaris reeds jaren een belangrijk onderzoeksdomein. De hier beschreven studie kadert in dit onderzoeksgeheel en focust zich op de bacteriële partner, meerbepaald op de rol van de rhizobiële oligopeptide ABC-transporter in de interactie tussen plant en bacterie. Tijdens een voorgaande studie naar genen die een sleutelrol spelen bij de late stappen van de symbiose werd een mutantenbank van R. etli geconstrueerd. Eén van de mutanten die werden geïdentificeerd bleek gemuteerd in een oligopeptide ABC-transporter (Opt). Deze mutant vertoonde in vergelijking met wildtype R. etli een verminderde stikstoffixatiecapaciteit. Op basis van deze resultaten werd besloten het Opt systeem te karakteriseren. In een eerste deel werd de sequentie bepaald van de genomische locus die het gemuteerde opt gen bevat. Deze locus bevat acht genen, waaronder vier (opt) genen coderend voor de vier subeenheden van een oligopeptide ABC-transporter (Opt). Om deze R. etli opt genen te karakteriseren, werden een aantal opt mutanten geconstrueerd en geëvalueerd, zowel op plant als tijdens vrijlevende condities. Planten geïnfecteerd met R. etli opt mutanten vertoonden een verminderde symbiotische stikstoffixatie-activiteit. Groeitesten uitgevoerd op opt mutanten in aanwezigheid van oligopeptiden als enige stikstofbron bevestigden dat de opt genen betrokken zijn bij de opname van oligopeptiden. Bovendien bleken de opt mutanten een verhoogde resistentie te vertonen tegen het oligopeptide antibioticum bacitracin, een verhoogde gevoeligheid te vertonen voor het β-lactam antibioticum ampicilline en een verminderde osmotolerantie te hebben. Dit toont aan dat de opt locus van R. etli van belang is bij verschillende vormen van stressrespons. Een transcriptionele studie van de opt regio werd ook uitgevoerd. Met behulp van reportergen fusieconstructen werd aangetoond dat de opt regio zowel tijdens vrijlevende als symbiotische condities tot expressie komt en dat de expressie groeifase afhankelijk is. Bovendien werden aanwijzingen gevonden voor een inducerende component. Aangezien oligopeptide ABC-tranporters in verband worden gebracht met celwandrecyclage en met vele processen die mogelijk beïnvloed worden door modificaties in de structuur van peptidoglycaan, is de R. etli Opt transporter mogelijk betrokken bij het wijzigen van de celwandstructuur. In een preliminaire studie werd de sturctuur van R. etli peptidoglycaan geanalyseerd via LC-MS/MS. De bekomen data bevestigen dat de peptidoglycaanstructuur van R. etli lijkt op de archetypische peptidoglycaanstructuur van Gram-negatieve bacteriën.