Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Interne geneeskunde --- Médecine interne --- #BIBC:T1995 --- Academic collection --- 616-007 --- DNA-onderzoek --- erfelijkheid --- geneeskunde --- mucoviscidose --- pathologie --- stofwisseling --- Theses

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Academic collection --- Theses

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Kopijnummerpolymorfismen zijn naast SNPs een belangrijke vorm van genetische variatie. De α- en β-defensinelocus op chromosoom 8p23 vertoont een dergelijke variatie. Defensines spelen een belangrijke rol in het gezond houden van de barrière functie van het epitheelweefsel. Enerzijds hebben ze een antimicrobiële werking, anderzijds zijn ze chemotactisch voor cellen van zowel het aangeboren als van het verworven immuunsysteem. Daarom hebben we de kopijnummervariatie van deze genen in kaart gebracht en de betrokkenheid van defensines onderzocht in ziekten waarbij de epitheelbarrière verstoord is zoals COPD, mucoviscidose, de ziekte van Crohn en parodontitis. Omdat er bij aanvang van deze studie geen gevalideerde test voorhanden was voor de kwantificatie van kopijnummers, hebben we zelf een kwantitatieve test ontwikkeld op basis van kwantitatieve PCR. Om een accurate test te verkrijgen, hebben we referentieconstructen aangemaakt met een gekend aantal kopijen van het herhaalde gen en 1 kopij van een referentiegen. Op deze wijze kunnen we via een standaardcurve het kopijnummer bepalen. Vervolgens hebben wij deze test gevalideerd met interfase FISH en ze gebruikt om de α- en β-defensineregio te karakteriseren. Uit deze analyses is gebleken dat de β-defensineregio een spreiding heeft van 2 tot 8 kopijen per diploïd genoom met een gemiddelde van 4 kopijen. Tevens bleek dat het DEFA1A3 gen 3 tot 10 keer voorkomt met een gemiddelde van 6 kopijen per diploïd genoom. Het kopijnummer van het DEFA1A3 gen bleek bovendien onafhankelijk te zijn van het kopijnummer van de β-defensineregio. Wanneer we het aantal kopijen groepeerden volgens leeftijd en geslacht, merkten we een leeftijds- en geslachtsafhankelijke distributie van het β-defensinekopijnummer. De distributie bleek daarenboven populatieafhankelijk te zijn. De verschillende strategieën die we tot nu toe gebruikt hebben om dit fenomeen beter te begrijpen hebben nog geen verklaring kunnen brengen. Zo is er geen variatie in het kopijnummer tussen verschillende soorten bloedcellen. Ook hebben we geen verschil in kopijnummer kunnen vaststellen tussen bloed en mondweefsel van dezelfde persoon. Verder hebben FISH-experimenten niet kunnen aantonen dat β-defensine genen als extrachromosomaal DNA voorkomen. Na de karakterisatie van het kopijnummerpolymorfisme hebben we functionele studies uitgevoerd met oraal epitheelweefsel en aan parodontitis gerelateerde bacteriën. Het effect van twee mondpathogenen ( Porphyromonas gingivalis en Actinobacillus actinomycetemcomitans) , zowel als van twee commensale bacteriën ( Fusobacterium nucleatum en Escherichia coli ), evenals van twee stimulerende agentia (PMA en TNFα), werd nagegaan op de β-defensine en IL-8 expressie in mondeptiheelweefsel. Uit deze studies is gebleken dat commensale bacteriën een ander β-defensine inductiepatroon vertonen dan pathogene bacteriën. Aangezien pathogene bacteriën zorgen voor een verminderde opregulatie van de β-defensines, ontsnappen ze aan het afweermechanisme van het epitheelweefsel en kunnen ze het weefsel binnendringen en ziekte veroorzaken. Voor mucoviscidose hebben we zowel een associatiestudie als functionele studies uitgevoerd. Uit de associatiestudie is gebleken dat patiënten met meer β-defensine-kopijen een milder longfenotype hebben en tevens ook een hogere levens-verwachting. We hebben dit positief effect van een hoger aantal β-defensinekopijen verder onderzocht door epitheelcellen met respectievelijk veel en weinig β-defensinegenen in cultuur te brengen. Uit deze experimenten is gebleken dat wanneer er veel β-defensinekopijen aanwezig zijn, de expressie van deze genen verhoogd wordt onder invloed van pro-inflammatoire stimuli zoals bijv. TNFα. Deze opregulatie zorgt voor een betere bescherming tegen infecties door Peudomonas aeruginosa . Dit is een belangrijke, CF gerelateerde, pathogene bacterie die zorgt voor chronische longinfecties . Bij de ziekte van Crohn en bij COPD echter bleken te veel β-defensinegenen een ongunstig effect te hebben. Een hoger kopijnummer van de β-defensinegenen blijkt geassocieerd te zijn met aantasting van de dikke darm bij de ziekte van Crohn, deze associatie was het sterkst bij patiënten waar de ziekte zich op jongere leeftijd manifesteert. Daarnaast hebben we kunnen aantonen dat, bij Crohn’s patiënten die behandeld worden met TNFα blokkers, een hoog aantal kopijen van de β-defensinelocus gelieerd is aan het ontwikkelen van psoriatische huidletsels. Bij COPD patiënten bleek tevens een hoger aantal β-defensinekopijen geassocieerd te zijn met de ziekte. Een hoog aantal β-defensinekopijen bij COPD en de ziekte van Crohn draag wellicht bij tot een versterking van de ziekteverwekkende immuunreactie. Naast dit β-defensine effect hebben we ook vastgesteld dat een hoog kopijnummer van het DEFA1A3 gen geassocieerd is met chronische afstoting van de getransplanteerde long bij COPD patiënten die een longtransplantatie hebben ondergaan. Het aantal kopijen van de β-defensineregio blijkt dus van belang te zijn voor het gezond houden van de epitheelbarrière. De β-defensine CNV is vandaag de dag wellicht de klinisch meest relevante CNV. Copy number variations (CNVs) are besides single nucleotide polymorphisms (SNPs) an important form of individual genetic variation. The α- and β-defensin locus on chromosome 8p23 shows extensive copy number variation. Defensins play an important role in keeping the epithelial barrier into a healthy state. On one hand, they are antimicrobial agents; on the other hand they are chemotactic agents for cells of the acquired immune system. Therefore, we have determined the copy number variation of those genes and we have investigated the possible influence of the copy number polymorphism in diseases of the epithelial barrier like COPD, cystic fibrosis, Crohn’s disease and periodontitis. At the start of this project, no validated test to quantify extensive copy number variation was available. We developed therefore a quantitative test, based on real time PCR. To standardize the test, we developed concatemeric reference constructs with a known number of copies of the repeated gene of interest and a single copy of a reference gene. With the data of these reference constructs, a standard curve was made, which was subsequently used to determine the copy number in samples. We have shown that the β-defensin CNV contains 2 to 8 copies in a diploid genome with a mean copy number of 4. The DEFA1A3 copy number was shown to vary from 3-10 with a mean copy number of 6. Moreover, the diploid DEFA1A3 copy number was independent of the diploid β-defensin copy numbers. When the copy numbers were stratified according to age and gender, an age- and gender-dependent copy number variation was observed. The copy number variation was also population dependent. Different approaches were followed to understand this variation, but until now, none of them proofed to be successful. To examine somatic variation, the copy number in blood and mouth epithelium of the same person was analyzed. The same copy numbers were concluded in both tissues. FISH experiments did not reveal the presence of extrachromosomal DNA containing the β-defensin genes. We also performed functional studies with oral epithelial tissue and periodontitis related bacteria. The upregulation of the β-defensin genes after induction with two pathogens (Porphyromonas gingivalis and Actinobacillus actinomycetemcomitans) and with two commensal bacteria (Fusobacterium nucleatum and Escherichia coli) was evaluated. The influence of PMA and TNFα on the expression of the different β-defensin genes and IL-8 was also investigated. These experiments pointed out that the commensal bacteria have a different β-defensin induction pattern than pathogenic bacteria. Pathogenic bacteria were shown to upregulate hBD2 to a lesser extent. This increases probably their capacity to invade the epithelium. In the cystic fibrosis study, we performed functional studies as well as an association study. The association study showed that a higher diploid β-defensin copy number was found in patients with a milder lung phenotype and in older age groups. We further investigated the positive effect of a high diploid β-defensin copy number by culturing nasal epithelial cells with a low and a high diploid β-defensin copy number and challenged them with TNFα and Ps. aeruginosa. These experiments showed that when epithelial cells have a high β-defensin copy number, the expression is induced by TNFα and in turn this induction results in a better bactericidal activity against Ps. aeruginosa. For Crohn’s disease and COPD, we investigated whether an association between the α- and β-defensin CNV and the disease exists. A high diploid β-defensin copy number was associated with Crohn’s disease of the colon and this association was the strongest in the group with the youngest age of onset. Patients with COPD had a higher β-defensin copy number than control individuals. A high β-defensin copy number might contribute to the excessive inflammation seen in these patients. The α-defensin CNV was associated with chronic rejection of the transplanted lung in COPD patients. The β-defensin copy number seems to be important in keeping the epithelial barrier in a healthy state. This way, the β-defensin CNV is probably one of the most clinically relevant CNVs discovered so far. Recentelijk wordt het steeds meer duidelijk dat veel genen niet 1 keer voorkomen op een chromosoom, maar dat er meerder kopijen van genen of van zelfs hele regio’s kunnen voorkomen. Dit is een nieuwe vorm van genetische variatie waarvan we het belang nog niet kennen. De defensinegenen liggen in een regio die meerdere keren kan voorkomen per chromosoom. Er bestaan twee soorten defensine genen, alpha-defensines en beta-defensines. Deze genen spelen een hele belangrijke rol in het gezond houden van ons lichaam. De grens tussen de binnenkant van ons lichaam en de omgeving bestaat uit epitheelcellen, zoals de huid. Deze grens wordt beschermt door natuurlijke antibiotica’s, zoals de defensines. Naast hun rol als antibiotica hebben ze ook een belangrijke rol in het ontstaan van ontsteking. Aangezien het evenwicht tussen de verschillende factoren die zorgen voor een ontstekingsreactie van groot belang is, hebben we onderzocht of het aantal kopijen een rol kan spelen in ziekten waar dit evenwicht verstoord is zoals bij emfysema, de ziekte van Crohn, parodontitis en mucoviscidose. In een eerst fase hebben we een test ontwikkeld om zeer correct het aantal kopijen te kunnen bepalen van de defensinegenen. Met deze test hebben we dan het aantal kopijen bepaald in gezonde personen. Uit deze experimenten is gebleken dat het kopijnummer van de beta-defensinegenen verandert met de leeftijd. Vervolgens hebben we proberen te achterhalen wat de oorzaak hiervan is, maar tot nu toe hebben we nog geen verklaring kunnen vinden. In een volgende fase van het onderzoek hebben we het aantal kopijen van de alpha-en beta-defensinegenen bepaald bij patiënten. We hebben kunnen aantonen dat mucoviscidose patiënten die meer van deze genen hebben, langer leven dan patiënten met minder genen, ook is de conditie van hun longen beter. Na verder onderzoek bleek dat wanneer er meer beta-defensinegenen aanwezig waren, deze patiënten beter beschermd zijn tegen longinfecties. Voor de andere ziekten die we onderzocht hebben bleek het beter om weinig beta-defensinegenen te hebben. Bij de ziekte van Crohn en bij emfyseem spelen ontstekingsreacties een grote rol, de aanwezigheid van veel beta-defensingenen zal deze ontsteking waarschijnlijk in de hand werken. Ook hebben we ontdekt dat bij patiënten met de ziekte van Crohn, die ontstekingsremmers krijgen, een hoog aantal beta-defensine genen het ontwikkelen van huidletsels in de hand werkt. Een hoog aantal alpha-defensinegenen blijkt echter betrokken te zijn bij de afstoting de gentransplanteerde longen na longstransplantatie. Recently is has been found that some genes and even whole genomic regions do not occur only ones on a chromosome, but can be repeated several times. This is a new form of genetic variation. The defensins genes are located in such a region. There exist to types of defensins, α-defensins and β-defensins. These genes have an important function in keeping our body in a healthy state. The border between the inside and the outside is composed of epithelial cells, like the skin. This border is protected by natural antibiotics like the defensins. Besides their role as natural antibiotics, they also have a function in inflammation. The different factors that are involved in inflammation have to be in equilibrium, when this equilibrium is disturbed, disease is established. This way, the number of β-defensin genes can have a role in diseases of the border between the inside and the outside. To investigate if indeed the copy number is important in some disease we have first developed a test to determine very precisely the copy number of the defensin genes. This test was than used to look at the copy numbers in healthy individuals. To our surprise, the β-defensin copy number varied with the age of the individual. We tried to find an explanation, but were not successful. In a next phase, the copy numbers of the α- and β-defensin genes was determined in patients. We demonstrated that patients with a higher β-defensin copy number live longer and that the condition of their lungs is better. Further investigation showed us that patients with a higher β-defensin copy number are better protected against infections. For the Crohn’s disease and COPD, a low copy number of the β-defensin genes was beneficial for the patients. A too strong inflammation is involved in these diseases; probably a high β-defensin copy number will promote this inflammation. Furthermore, we have discovered that patients with Crohn’s disease, who take immunosuppressive drugs and have a high β-defensin copy number, are more vulnerable in developing skin problems. A high α-defensin copy number showed to be involved in chronic rejection of the transplanted lungs.

Academic collection --- 612.6 --- 575 --- Reproduction. Growth. Development --- General genetics. General cytogenetics. Immunogenetics. Evolution. Speciation. Phylogeny --- Theses --- 575 General genetics. General cytogenetics. Immunogenetics. Evolution. Speciation. Phylogeny