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Le dogme de la biologie a souvent considéré l’ARN comme un intermédiaire entre l’information génétique contenue dans l’ADN et la protéine qui assure les fonctions biologiques d’un organisme. Cependant, des études ont démontré que 70 % du génome des eucaryotes sont transcrits en ARNs mais seulement 2 % de ces transcrits sont traduits en protéines. Cette observation indique que 98 % des ARNs transcrits ne sont pas traduits en protéines et sont ainsi nommés ARNs non-codants (ARNsnc). Ces derniers sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques, alors que leur dérégulation est associée à diverses pathologies. La majorité de ces transcrits adoptent une structure 3D complexe pour accomplir leur fonction biologique et sont ainsi nommés ARNs structurés (ARNsst). Cependant, à l’heure actuelle, très peu d’ARNsst ont été caractérisés ce qui reflète la complexité de ces molécules ainsi que le manque d’outils actuellement disponibles pour les étudier. Dans ce contexte, le développement de nanobodies (nbs : fragments d’anticorps de camélidés) dirigés contre ces ARNsst vise à faciliter l’étude structurale et fonctionnelle de ces derniers. Préalablement à mon arrivée, une librairie synthétique de nbs a été générée et criblée par phage display contre un ARN qui consistait en la fusion de deux ARNsst d’intérêt : i) BC1 : un ARNst exprimé dans les neurones et dont la structure est inconnue; ii) le ribozyme glmS (ribglms) : un ARNst catalytique dont l’activité est caractérisée et facilement mesurable. L’intérêt d’une telle fusion est d’attester du bon repliement de l’ARN grâce à l’activité catalytique du ribozyme. 

Dans la cadre de mon travail de fin d’étude, nous nous sommes focalisés sur la production, la purification et la caractérisation d’un des nbs sélectionnés lors du criblage de la librairie contre l’ARN fusion BC1-ribglmS. Par interférométrie laser, nous avons démontré que ce nb lie la partie BC1 de l’ARN fusion avec une forte affinité (de l’ordre du nM). Des mesures d’affinité réalisées en présence d’EDTA (qui déstabilise la structure 3D de l’ARN par chélation des ions Mg2+) ont permis de déduire que ce nb interagit avec un élément de structure secondaire de l’ARNst. Les résultats obtenus lors de l’étude de la spécificité du nb, indiquent qu’il est spécifique de l’ARNst car il ne lie pas l’ARNsb, l’ARNdb, l’ADNsb, l’ADNdb ou la BSA. Néanmoins, une interaction entre le nb et différents ARNsst, autres que BC1, a été observée. Nous supposons que ce nb reconnaît donc un/des élément(s) de structure(s) secondaire(s) communs aux différents ARNsst. 

Par des expériences de dichroïsme circulaire, nous avons démontré que la liaison du nb à l’ARN modifie son comportement de dénaturation et renaturation thermique. Enfin, nous avons également mis en évidence que la liaison du nb à l’ARN fusion est associée à une certaine protection de ce dernier vis-à-vis de la dénaturation chimique par traitement au Diméthyl Sulfoxide (DMSO). 

En conclusion, les résultats obtenus dans le cadre de ce travail valident l’approche expérimentale d’obtention de nbs dirigés contre l’ARNst même si leur spécificité reste à optimiser.

nanobody --- ARN structuré --- Sciences du vivant > Biochimie, biophysique & biologie moléculaire

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Une souche de Klebsiella pneumoniae résistante aux antibiotiques à noyau bêta-lactame a été isolée au CHR de Verviers. Cette résistance est associée à la production d’une nouvelle métallo-bêta-lactamase (MBL) nommée VIM-52. Elle se distingue de la MBL VIM-1 par la substitution de l’histidine 224 par une Arginine. Dans le cadre de ce travail, nous avons produit, purifié et établi le profil cinétique de VIM-52. Par ailleurs, nous avons produit le mutant H224K de VIM-1 et les mutants S228R et S228D de VIM-52. Enfin, nous avons étudié l’impact de la substitution de la Valine 67 en Tyrosine. Nous avons montré que la substitution de H224 de VIM-1 par une lysine ou une arginine (VIM-52) augmente l’activité de l’enzyme vis-à-vis de la céfotaxime et diminue celle vis-à-vis de la céfépime et la ceftazidime. Cependant, seule la présence d’une Lysine en position 224 augmente l’efficacité de l’enzyme envers les carbapénèmes. La mutation de S228 de VIM-52 par Asp ou Arg augmente globalement l’activité catalytique. Bien que l’augmentation d’activité la plus nette est observée pour la mutation S228R, la présence de la chaîne latérale de l'arginine provoque également une forte diminution des interactions avec la céfépime et la ceftazidime. Le mutant VIM-1 Y67V ne présente aucun changement significatif dans son spectre d’activité.
La deuxième partie de ce travail s’inscrit au sein de la recherche de nouvelles molécules inhibitrices de MBLs. En collaboration avec le groupe du Professeur Hernandez (Université de Montpellier, Fr), nous avons testé une librairie de composés dérivés de la 1,2,4-triazole-3-thione. Ce composé inhibe les MBLs en interagissant directement avec les ions zinc du site actif des enzymes. Ces inhibiteurs ont été testés sur trois MBLs représentant chacune une sous-classe : VIM-4 pour la sous-classe B1, CphA pour la sous-classe B2, et L1 pour la sous-classe B3. Le Ki de treize de ces composés inhibiteurs a été déterminé comme étant de l’ordre du mM pour VIM-4. La valeur de Ki la plus basse, 0.95 µM, étant obtenue pour le composé JMV6644. Six de ces composés ont également été actifs sur L1, avec des Ki variant entre 3 µM et 85 nM. Ce Ki étant atteint par JMV5999, un des deux seuls composés avec JMV6118 inhibant les trois MBLs testées, et présentant des Ki de 9 µM pour VIM-4 et de 11 µM pour CphA. Avec son activité inhibitrice sur les trois classes de MBL, JMV5999 semble être le composé le plus prometteur.

Sciences du vivant > Biochimie, biophysique & biologie moléculaire

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