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The GLOMULIN gene (GLMN), which codes for a protein of the same name, was identified in the laboratory of Prof Miika Vikkula, where this thesis was undertaken. This gene, when mutated, is responsible for a particular sub-type of vascular anomaly: glomuvenous malformations (GVM). GVMs are cutaneous lesions charaterized by enlarged venous channels, surrounded by abnormally-differentiated vascular smooth muscle cells (vSMCs), called “glomus cells”. GLOMULIN protein is normally expressed by vSMCs, and seems to play a role in their differentiation, through interactions with components of the TGFb and HGF signaling pathways. A variety of double-hits that cause complete localized absence of GLOMULIN, have been identified in the context of GVM lesions. While studies have yielded many insights into the nature of this molecule, the precise function of GLOMULIN remains to be unravelled. The aim of this thesis, therefore, was a detailed assessment of GLOMULIN expression, in order to further our understanding of the protein and its functions.
In the course of this study, we characterized a commercially available antibody to GLOMULIN, which we then used in order to analyze expression of the protein in healthy and GVM-tissue by immunohistochemistry. The antibody being specific for the human protein, we studied Glmn expression during development using in situ hybridization instead, to assess for RNA-expression in paraffin-sections derived from mouse embryos. Thus, the expression of this molecule in wild-type mice at different developmental stages, was compared to that of a variety of other vSMCmarkers, tools which will allow for better characterization of GLOMULIN expression in human tissues, as well as in knock-out and transgenic mice Le gène GLOMULINE (GLMN), codant pour une protéine du même nom, a été identifié au sein du laboratoire hôte de ce mémoire. Ce gène, lorsqu’il est muté, est responsable d’un sous-type d’anomalies vasculaires : les malformations glomuveineuses (GVM). Les GVM sont des lésions cutanées qui se caractérisent par un élargissement des canaux veineux et par la présence, autour de ces vaisseaux, de cellules musculaires lisses mal différenciées, nommées cellules glomiques. La protéine GLOMULINE est normalement exprimée par les cellules musculaires lisses vasculaires. Il semble que cette protéine joue un rôle dans la différenciation de ces cellules en interagissant avec des éléments des voies de signalisation du TGFβ et du HGF. Il a également été identifié, au sein des lésions glomuveineuses, différents doubles hits qui entrainent une absence localisée de la GLOMULINE. Malgré les connaissances que nous possédons sur ce gène et sa protéine, la fonction de la GLMN reste encore méconnue. Le but de ce mémoire était, dès lors, d’acquérir une connaissance plus précise sur l’expression de cette protéine, afin que nous puissions par la suite mieux comprendre sa (ses) fonction(s).
Au cours ce mémoire, nous avons caractérisé un anticorps commercial dirigé contre la GLOMULINE, afin d’analyser par immunohistochimie l’expression de cette protéine dans des tissus sains et pathologiques. Cet anticorps ne reconnaissant que la protéine humaine, nous avons également adapté la technique d’hybridation in situ pour caractériser l’expression de l’ARN de Glmn sur des coupes en paraffine d’embryons de souris. L’expression de la Glmn, chez des souris sauvages à différents stades embryonnaires, a été comparée à celle d’autres marqueurs de cellules musculaires lisses. Ces outils pourront, par la suite, être utilisés pour compléter la caractérisation de l’expression de la GLOMULINE, d’une part dans les tissus humains, et d’autres part chez les souris knock out et transgéniques

GLMN protein, human --- Central Nervous System Vascular Malformations --- Vascular Diseases --- Transforming Growth Factor beta --- Myocytes, Smooth Muscle

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Primary lymphedema is a rare, genetically variable disorder. lt is characterized by chronic edema and usually affects the lower extremities. Primary lymphedema can be present at birth, develop around the time of puberty or appear after 35 years of age. Among the 563 index cases of the host laboratory, only 40 % is explained by mutations in one of the 20 genes acting around the VEGFR3 pathway, a key player in lymphangiogenesis. In the first part of this thesis, we screened a new candidate gene proposed by a collaborator. The inhibition of this gene by morpholinos decreased the expression of VEGFR3 in Zebrafish, leading to lymphedema. In total, 218 patients were screened. Six known polymorphisms were observed, but no damaging .mutation was detected. However, we cannot exclude a partial or total deletion of the gene, which is undetectable by direct sequencing. lt is also possible that mutations in this gene are extremely rare and therefore were absent in the tested series, or are too damaging and incompatible with lite. The second part of the thesis focused on the effects of 11 mutations identified in HGF. We generated expression vectors for six mutants and the wild-type human HGF. We transfected COS-7 cells and verified expression, stability and secretion of each mutant. Most of the mutant vectors seem to result in cellular HGf expression at a level similar to WT. However, the majority of the mutants are secreted at a lower level than WT. Considering that HGF acts in a dose-dependent manner, the small difference in secretion could influence the level of response of cells expressing the HGF receptor, c-MET. The ability of the mutants to bind to c-MET and activate the downstream signaling pathway is under investigation.The third part of this thesis was devoted to the study of 11variants identified in the TSC1 and TSC2 genes. Mutations in these genes are mainly responsible for tuberous sclerosis, which can sometimes be associated with lymphedema. ln order to investigate the effects of these 11 variants, we started a collaboration with the department of clinical genetics, Erasmus Medical Center in Rotterdam. They are experts in functional analysis of TSC1 and TSC2 variants. For this, we generated variants by site-directed mutagenesis.7 mutants have already been sent to Rotterdam and functional studies on the classic signaling pathway of 6 TSC2 mutants have been performed. The activity of TORC1 for each variant was estimated by calculating the ratio of phosphorylated SG kinase to total 56 kinase, as measured by immunoblotting. No major effect on the canonical pathway was observed. The interaction with other partners has to be explored in further detail. Le lymphœdème primaire est une pathologie rare, souvent d'origine génétique, caractérisée par un œdème chronique, majoritairement des membres inférieurs. Il peut être congénital, apparaître pendant la puberté ou se manifester après 35 ans. Parmi 563 cas index de laboratoire d'accueil, seulement 40 % sont expliqués par des mutations dans 20 gènes agissant autour de la voie du VEG FR3, un facteur clé de la lymphangiogenèse. La première partie de ce mémoire consistait à cribler un nouveau gène candidat identifié par un collaborateur. En effet, lorsque l'expression de ce gène était inhibée par des morpholinos, une diminution de l'expression du VEGFR3 était observée chez le Zebrafish, conduisant à un lymphœdème. Au total, 218 patients ont été criblés. Six polymorphismes connus ont été rencontrés, mais aucune mutation dommageable n'a été détectée. Nous ne pouvons toutefois pas exclure une délétion partielle ou totale du gène indétectable par le séquençage direct. Il se pourrait aussi que des mutations dans ce gène soient extrêmement rares et dès lors absentes dans la série testée, ou soient trop dommageables et incompatibles avec la vie. La deuxième partie du mémoire s'est focalisée sur l'impact de 11va riants trouvées dans HGF. Des vecteurs d'expression pour six mutants ainsi que le wild-type HGF humain ont été générés. Nous avons dans un premier temps transfecté des cellules COS-7 et vérifié l'expression, la stabilité et la sécrétion des mutants. La plupart des vecteurs mutants semblent induire une expression de HGF dans les lysats cellulaire quasi-identique au WT. Néanmoins, la majorité des mutants sont moins sécrétée dans le surnageant comparé au WT. Sachant que le ligand agit de manière dose-dépendante, cette faible différence de sécrétion pourrait influencer in vivo le degré de réponse des cellules exprimant le récepteur c-MET. La capacité des mutants à se lier au récepteur c-MET et à activer de la voie de signalisation en aval de celui-ci sont en cours d'investigation.La troisième partie de ce mémoire était consacrée à l'étude de 11changements identifiés dans les gènes 1et TSC2. Dans la littérature, les changements rencontrés dans ces deux gènes sont principalement à l’origine de la sclérose tubéreuse de Bourneville qui, dans certains cas, peut être associée à un lymphœdème. Afin d'étudier l'impact de ces changements, une collaboration a été mise en place avec le département de génétique du centre médical Erasmus à Rotterdam, spécialisé dans l'étude fonctionnelle des variants de TSC1 et TSC2. Nous avons effectué la mutagenèse dirigée pour ces changements. 7 mutants ont déjà été envoyés à Rotterdam et l'étude fonctionnelle de 6 mutants TSC2 a été réalisée. L’activité de TORC1 a été estimée dans des cellules HEK 293T transfectées, en calculant le ratio entre S6 kinase phosphorylée et S6 kinase totale, mesurées par immunoblotting. Nous n'avons pas vu d'effet sur cette voie canonique. L'interaction avec d'autres partenaires devra donc être explorée plus en détail.

Lymphedema --- Genes

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Primary lymphedema, characterized by a chronic edema, results from defective lymphatic drainage due to abnormal lymphatic vessel development or dysfunction. Among patients affected with lymphedema, associated or not with a syndrome, mutations in at least twenty genes have been identified. Around 40% of the 475 index cases collected by the laboratory can currently be explained by mutations in these genes. Thus, about 60% remain unexplained. In the first part of my work, I focused on the sequencing of a new primary lymphedema gene discovered by the host laboratory by whole exome sequencing to confirm its implication in the pathology. Four mutations were identified by Sanger sequencing in a cohort of 184 patients, including 40 familial cases and 144 sporadic or unclassified ones. This gene comprises 9 exons and code for a protein expressed by endothelial cells. It’s a ligand of a well known endothelial-specific tyrosine kinase receptor. In the second part of this work, we used the small high-throughput sequencing machine Ion Torrent to sequence 66 candidate genes, using a custom AmpliSeq panel designed by our laboratory. This panel contains the 20 genes known to be involved lymphedema, three new genes recently discovery by the laboratory and about 40 candidate genes that encore proteins with direct or indirect implication in the development of the lymphatic system, because of their interaction with protein encoded by the 20 known genes. This new approach reduces drastically the time needed to discover new lymphedema causing genes and will improve the diagnostics of this pathology. At term, the identification of novel genes will allow better understanding of the origin of lymphedema and open the way for development of new treatments. Le lymphœdème primaire est caractérisé par un œdème chronique causé par un drainage lymphatique défectueux dû à un mauvais développement des vaisseaux lymphatiques ou d’une altération fonctionnelle de ceux-ci. Parmi les patients souffrant de lymphœdème primaire héréditaire ou sporadique associé ou non à un syndrome, des mutations dans une vingtaine de gènes ont été identifiées. Environ 40% des 475 cas de lymphœdèmes primaires du laboratoire d’accueil sont actuellement expliqués par une mutation dans un de ces gènes, ce qui laisse encore environ 60% des cas à élucider. Dans la première partir de mon mémoire, je me suis focalisée sur le criblage d’un nouveau gène identifié par séquençage d’exome afin de confirmer son implication dans le développement du lymphœdème primaire. Au total, 4 mutations ont été identifiées par séquençage de Sanger dans une cohorte de 184 patients, à savoir 40 cas familiaux et 144 cas sporadiques. Ce gène se compose de 9 exons et code pour une protéine exprimée dans les cellules endothéliales, agissant comme ligand d’une récepteur tyrosine kinase. Dans la seconde partie de mon mémoire, nous avons utilisé le mini séquenceur haut débit Ion Torrent pour cribler 66 gènes candidats intégrés dans un panel Ampliseq que nous avons fait synthétiser. Ce panel comprend les « gènes de lymphœdème », trois nouveaux gènes découverts récemment par le laboratoire et une quarantaine de gènes candidats codant pour des protéines ayant une implication directe ou indirecte dans le développement du système lymphatique, notamment par interaction avec des protéines encodées par les 20 gènes connus. Plusieurs mutations potentielles ont été observées et pour les patients dont nous disposons de l’ADN d’autres membres de la famille, un séquençage sera effectué afin de vérifier si le changement coségrège avec la pathologie. Cette nouvelle stratégie conduit à un gain de temps considérable dans l’identification de nouveaux gènes causal et permettra à l’avenir de faciliter le diagnostic. A terme, cela permettra de mieux comprendre l’origine des lymphœdèmes et ouvrira la voie au développement de nouveaux traitements

Lymphedema