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The adipocyte-derived hormone, ACRP30 (adipocyte complemented related protein of 30 kDa) affects body weight, increases fatty-acid oxidation and enhances insulin sensivity. As catecholamines play a major role in fuel homeostasis, we have studied the effects of β-adrenergic agonists and cAMP, their second messenger, in ACRP30 gene expression, protein production and secretion in mouse in vitro and in vivo.
After 10h of culture, cAMP decreased ACRP30 secretion by mouse adipose explants. This decrease was due to a marked depletion of tissues ACRP30 protein and mRNA levels. Moreover, in the presence of cAMP, ACRP30 secreted in the medium migrated as two species of apparent molecular masses of 32 and 30 kDa. The former, which was also detected in control medium, was sorted into secretory vesicles associated with the membrane fraction. The latter could be an immature form that did not undergo post-translational modifications and was exported after emptying of an intracellular pool, recovered in the cytosol fraction. These dual effect of cAMP were mimicked by β-adrenergic agonists, the selective β3 (BRL 37344) being the most potent in vitro. The agonist was tested in vivo. Administration of BRL 37344 to mice caused a 40-50 % reduction of ACRP30 mRNA levels in visceral and subcutaneous adipose depots and a 60% decrease in plasma ACRP30 levels
in conclusion, cAMP and β-adrenergic agonist exert a dual (pre- and post- translational) effect on ACRP30 secretion in culture mouse adipose explants. The inhibitory effect of β-adrenergic agonists was reproduced in vivo. The decrease in ACRP30 may be a novel, β-adrenoceptor-mediated mechanism, by which catecholamines affect fuel homeostasis. As ACRP30 stimulates fatty-acid oxidation and thermogenesis, the ability of catecholamines to decrease ACRP30 production suggest an inhibitory feed-back role for these hormones Le tissu adipeux est l’un des déterminants majeurs de la biodisponibilité des lipides circulants. Les catécholamines, par le biais des récepteurs β-adrénergiques, sont les hormones lipolytiques par excellence. De plus, elles stimulent la thermogenèse et l’oxydation des acides gras. Outre son rôle dans le stockage et la mobilisation des triglycérides, l’adipocyte a une fonction endocrine propre. L’ACRP30 (adipocyte complement related protein of 30 kDa) est une hormone adipocytaire qui, en favorisant l’utilisation préférentielle des substrats énergétiques (oxydation des acides gras) et en augmentant la sensibilité à l’insuline, influence le métabolisme et l’homéostasie énergétique. Nous avons étudié les effets des catécholamines (et plus particulièrement ceux des agonistes des récepteurs β-adrénergiques et de leur second messager, l’AMPc) sur l’expression du gène, la production et la sécrétion d’ACRP30 chez la souris in vitro (explants de tissu adipeux) et in vivo.
Après 10 heures de culture, l’AMPc a diminué la sécrétion d’ACRP30 par les explants, suite à une déplétion du contenu intra-tissulaire de la protéine, elle-même consécutive à une réduction du taux des ARNm correspondants. Par ailleurs, l’AMPc a dissocié l’ACRP30 secrétée en deux isoformes de poids moléculaires distincts (32 et 30 kDa), cette dernière correspondant à la vidange d’un « pool » intra-adipocytaire cytosolique. L’isoforme de 30 kDa n’aurait pas subit de modifications post-traductionnelles, contrairement à celle de 32 kDa et pourrait être plus instable et plus facilement dégradée.
Ce double effet sur ACRP30 a été reproduit par le β-agonistes. A cet égard, l’agoniste β3 (BRL37344) qui s’est révélé particulièrement puissant in vitro a été testé in vivo. Des souris injectées au BRL 37344 ont vu leur taux d’ARNm ACRP30 réduit de 40 à 50 % dans les sites adipeux viscéraux et inguinaux et leur concentration plasmatique d’ACRP30 chuter de 60%.
En conclusion, l’AMPc et les agonistes des récepteurs β-adrénergiques exercent un double effet (pré- et post-traductionnel) sur la sécrétion d’ACRP30 dans des cultures d’explants de tissu adipeux de souris. L’effet inhibiteur est retrouvé in vivo. Cette inhibition de la sécrétion d’ACRP30 par les agonistes β-adrénergiques pourrait, par une boucle de rétrocontrôle, contrecarrer l’oxydation des acides gras et la thermogenèse induites par l’ACRP30

Adrenergic beta-Agonists --- Receptors, Catecholamine --- Tumor Necrosis Factor-alpha --- Genes, Bacterial

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Obesity belongs to a cluster of metabolic abnormalities (insulin resistance, type 2 diabetes, hypertension, dyslipidemia and hypofibrinolysis) leasing to an increased risk for cardio-vascular disease. There related disorders are components of the Metabolic Syndrome. It has become clear from epidemiological studies that some increase in the adipose tissue mass antedates the development of other disorders.
Adipose tissue (adipose and stromal-vascular fractions) synthesize and release a variety of peptides which may have regulatory properties. I have studied one of these peptides: adiponectin (ApN) is mainly synthesized by mature adipocytes. This hormone has a protective role against atherosclerosis, enhances insulin sensitivity and fatty-acid oxidation. Plasma ApN levels are paradoxically decreased in obese subjects.
To understand this paradoxical decrease, I have studied ApN regulation in visceral fat of lean and obese subjects and examined the contribution of the different adipose tissue fractions to ApN secretion. I have also studied the regulation of ApN gen expression in a non-fat cell, target for the anti-atherogenic effect of ApN , the macrophage.
ApN secretion by visceral adipose explants is decreased in obese subjects. Data from co-cultures (adipocytes / stromal-vascular cells) and adipocyte cultures in conditioned media suggest that stromal-vascular cells may stimulate ApN secretion by adipocyte of lean subjects. However, adipocytes of obese individuals seemed to be resistant to this stimulation. A factor released by stromal-vascular cells could regulate ApN secretion by adipocytes.
We next studied ApN gene regulation in murine macrophages in vivo and in vitro. Intraperitoneal injection of LPS (lipopolyasacharide) to mice reduced plasma ApN levels, but increased ApN mRNA levels in the spleen, a representative organ of mononuclear-macrophage system. In vitro, combination of INF-γ with several cytokines increased ApN Mrna in cultured peritoneal macrophages, while these cytokines exert a well-known inhibitory effect on ApN expression in adipocytes.
In conclusion, a factor released by stromal-vascular cells may regulate ApN secretion in human visceral adipose tissue. Cytokines may induce ApN expression in macrophages, an effect opposite to that observed in adipose tissue L’obésité est un facteur de risqué important, voire crucial dans la pathogénie d’une constellation d’anomalies métaboliques (insulino-résistance, diabète de type 2, hypertension artérielle, dyslipémie et hypofibrinose,…) connu sous le nom de syndrome pluri métabolique. Le tissu adipeux, composé d’une fraction adipocytaire et d’une autre stromale-vasculaire, synthétise et sécrète un grand nombre de facteurs bioactifs, les adipocytokines. Ces dernières on un rôle potentiel dans la pathogénie de ce syndrome. Parmi les adipocytokines, l’adiponectine (ApN) est quasi exclusivement synthétisée par les adipocytes matures. Chez le sujet obèse, les taux circulants d’ApN sont diminués par rapport au sujet mince. Afin de comprendre cette diminution, a priori surprenante, nous avons étudié la régulation de l’ApN dans le tissu adipeux de sujets minces et obèses et examiné la contribution des différentes fractions de ce tissu à la sécrétion d’ApN. Nous avons élargi cette étude à la régulation de l’expression du gène ApN dans une cellule non-adipeuse, me macrophage.
Nous avons d’abord confirmé l’existence dans le plasma du monomère d’ApN 530 kDA) dans des conditions réductrices, ainsi que celle de complexes de plus haut poids moléculaire dans les conditions natives. In vitro, la sécrétion d’ApN par les explants de tissu adipeux viscéral est diminuée chez les sujets obèses. Nous avons mené des expériences de co-culture (adipocytes/ cellules stromales-vesculaires) ainsi que des cultures d’adipocytes en milieu conditionné par des cellules stromales-vasculaires. Les cellules stromales-vasculaires stimulerait la sécrétion d’ApN par les adypocytes de sujets minces. Par contre, les adipocytes de sujets obèses semblent résistants à cette stimulation. Il existerait donc un facteur libéré par la fraction stromale-vasculaire contrôlant la production d’ApN par les adipocytes.
Nous avons ensuite étudié la régulation de l’ApN dans les macrophages murins in vivo et in vitro. Chez la souris, le traitement au LPS (lipopolysaccharide) diminue les taux plasmatiques d’ApN lais par contre, augmente les taux d’ARNm ApN dans la rate, organe représentatif du système mononucléaire-macrophage. In vitro, l’association de plusieurs cytokines augmente les taux d’ArNm ApN dans des macrophages péritonéaux en culture, alors qu’elle exerce un effet inhibiteur bien connu sur l’expression de ce gène dans le tissu adipeux

Adipose Tissue --- Macrophages --- Blotting, Northern --- Blotting, Western

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Several myopathies are characterized by the presence of a chronic inflammation that aggravates the disease. Such inflammation arises from a major production of pro-inflammatory cytokines, in particular TNFα and IL-Iβ. Adiponectin (ApN) is a hormone abundantly secreted by adipocytes under standard conditions. It exerts pleiotropic effects including as an insulin sensitizer, fat burner and anti-inflammatory. It has been shown in the laboratory that ApN stimulates the expression of mir-711. This micro-RNA helps to reduce inflammation through the downregulation of genes coding for proteins involved in the activation of the pro-inflammatory transcription factor NF-kB. MIR-711 also downregulates the expression of genes coding for proteins located upstream of the NLRP3 inflammasome complex, which is essential to cleave and thereby activate IL-Iβ in a variety of cell types. However, the presence and the role of the NLRP complex in skeletal muscle have not been investigated until now. The aim of this work is to study the expression and regulation of the NLRP3 complex in the skeletal muscle as well as its role in muscle inflammation. First, we showed the presence of NLRP3 in the muscle fibers. Second, we showed that treatment which ApN or miR-711 reduced the LPS-induced expression of NLRP3 in C2C12 cells. Conversely, inhibition of miR-711 abrogated the anti-inflammatory action of ApN on NLRP3, suggesting that ApN inhibits NLRP3 through miR-711. All of these data were also confirmed in vivo. Moreover, we showed that, in mdx mice, the expression of NLRP3 is strongly increased compared to the control mice whereas the overexpression of the ApN reduced NLRP3 in mdx mice. Finally, we showed that mdx mice deficient for NLRP3 have improved physical performance as well as reduced inflammation, oxidative stress and decrease muscle damage when compared to regular mdx mice. In conclusion, these data highlights a deleterious inflammatory role of the NLRP3 inflammasome complex in the progression of DMD while specifying the underlying mechanisms of the anti-inflammatory action of ApN and miR-711 thus opening new therapeutic perspectives to control muscle inflammation. De nombreuses myopathies se caractérisent par la présence d'une inflammation chronique qui joue un rôle aggravant dans la maladie. Cette inflammation résulte d'une sécrétion importante de différentes cytokines pro-inflammatoires, notamment du TNFa et de l'IL-1. L'adiponectine (ApN) est une hormone abondamment sécrétée par les adipocytes en condition normale. Elle exerce des effets pléiotropes notamment en tant que sensibilisateur à l'insuline, brûleur de graisse et anti-inflammatoire. Il a été montré au laboratoire que l'ApN était capable d'inhiber l'inflammation au niveau du muscle squelettique et ainsi d'améliorer les performances physiques de souris mdx, un modèle murin de la myopathie de Duchenne. Par ailleurs, il a récemment été démontré que l'ApN stimule l'expression du miR-711. Ce microARN contribue à diminuer l'inflammation via la répression de gènes codant pour des protéines impliquées dans l’activation du facteur de transcription pro-inflammatoire NF-KB. Le miR-711 inhibe également l'expression de gènes codant pour des protéines situées en amont de l'activation du complexe NLRP3 inflammasome qui s'avère essentiel dans différents types cellulaires pour cliver et ainsi activer la forme précurseur d'IL-1. Or, la présence et le rôle du complexe NLRP3 dans le muscle squelettique n'ont jusqu'alors pas été investigués. L'objectif de ce travail est donc d'étudier l'expression de NLRP3 dans le muscle squelettique, d'étudier sa régulation ainsi que son rôle dans l'inflammation du muscle squelettique. Dans un premier temps, nous avons montré la présence de NLRP3 dans les fibres musculaires. Dans un deuxième temps, nous avons montré qu'un traitement à l'ApN ou au miR-711 réduit l'expression, induite par le LPS, de NLRP3 dans les cellules C2Cl 2. A l'inverse, l'inhibition du miR-711 réduit l'action anti-inflammatoire de l'ApN sur NLRP3 suggérant que l'ApN inhibe NLRP3 via le miR-711. Ces données ont ensuite été confirmées in vivo. De plus, nous avons montré chez les souris mdx que l'expression de NLRP3 est fortement augmentée par rapport aux souris contrôles tandis que la surexpression de l'ApN chez des souris mdx induit une diminution de NLRP3. Dans un troisième temps, nous avons montré que des souris mdx déficientes pour NLRP3 présentent des performances physiques améliorées ainsi qu'une inflammation, un stress oxydatif et des dommages musculaires diminués par rapport aux souris mdx. En conclusion, ces données permettent de mettre en évidence un rôle inflammatoire délétère du complexe NLRP3 inflammasome dans l'évolution de la myopathie de Duchenne tout en précisant les mécanismes sous-jacents des propriétés bénéfiques anti-inflammatoires de l 'ApN et du miR-711, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour contrôler l'inflammation musculaire.

Inflammasomes --- NLR Family, Pyrin Domain-Containing 3 Protein --- Mice --- Muscular Dystrophy, Duchenne

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Obesity plays a causative role in a cluster of metabolic abnormalities (Syndrome X) leading to an increased risk for cardiovascular disease. However, the molecular link between obesity and atherosclerosis is still poorly understood.
The concept that adipocytes are secretory cells has emerged only recently. Adipocytes synthesise and release a variety of peptides which may have regulatory properties. Leptin, a true adipose hormone controls whole-body energy homeostasis, and its deficiency causes morbid obesity (ob/ob mice).
Among the “adipopeptides”, we have studied a newly identified factor, adiponectin (ApM) (also called ACRP30 in rodents). ApN is specifically and abundantly expressed in adipocytes, then secreted in the bloodstream. This protein is thought to play a protective role against atherosclerosis. Plasma ApN levels are reduced in patients with cardiovascular disease or in obese subjects. Several endocrine glucocorticoids turn-over, stress and altered sympathetic tone, and hyperinsulinemia/ insulin resistance. In the present work, we investigated the hormonal regulation of ApN/ACRP30 gene expression in humans and mice. Studies were performed in vitro and in vivo.
In cultured explants of human adipose tissue, ApN gene expression was negatively regulated by glucocorticoids and cAMP and positively by insulin and IGF-I. In view of the endocrine abnormalities associated with syndrome X, this regulation could contribute to decreased plasma ApN levels in these subjects. Adipose tissue may also contribute to control its own production of ApN by releasing a factor that destabilizes the mRNA.
In cultured explants of mouse adipose tissue, we excluded the possibility that TFN-α, a cytokine known to be involved in the pathogenesis of syndrome X, was this destabilization factor. We also extended the effects of cAMP (the second messager of catecholamines) to β-adrenergic receptor agonists and found that these agents inhibited ACRP30 mRNA both in vitro and in vivo. Eventually, leptin treatment of obese (ob/ob) mice partially restored ACRP30 mRNA abundance, which is usually blunted in these animals, and doubled plasma ACRP30 levels. This effect of leptin may involve both pre- and post-translational mechanisms.
In conclusion, we have begun to unravel the hormonal regulation of ApN/ACRP30 production in human and mice. Our data suggest that endocrine abnormalities in obesity and/or syndrome X may lead to decrease expression of ApN/ARCP30 gene and subsequent low plasma levels of the protein, thereby promoting cardiovascular disease.
Abnormal post-translational mechanisms could also theoretically contribute to impaired ApN production. Further studies focusing on this potential level of regulation are needed, as well as detailed in vitro and vivo characterization of ApN/ACRP30 effects L’obésité est clairement associée à une augmentation du risqué de maladies cardiovasculaires, dans le contexte du syndrome plurimétabolique. Toutefois, la relation exacte entre obésité et l’athérosclérose reste entre mal comprise. J’ai essayé de l’appréhender par le biais de l’activité sécrétoire de l’adipocyte. La leptine, déficiente chez la souris génétiquement obèse et diabétique (ob/ob), est une véritable hormone sécrétée par l’adipocyte et responsable de l’homéostasie énergétique. Parmi les adipopeptides, l’adiponectine (ApN) a retenu notre attention. Ses taux plasmatiques sont diminués chez le sujet obèse ou atteint de maladies cardiovasculaires, et l’ApN semble jouer in vitro un rôle protecteur sur l’athérosclérose. Afin de comprendre la diminution, a priori assez inhabituelle, d’un facteur adipocytaire chez l’obèse, nous avons étudié la régulation hormonale du gène codant ce facteur chez l’homme et le souris. Les études ont été menées in vivo et in vitro.
Nous avons tout d’abord montré que l’expression du gène codant l’ApN était régulée négativement par les glucocorticoïdes et l’AMPc, et positivement par l’insuline et l’IGF-1 dans des cultures d’explants de tissu adipeux humain. Au vu des anomalies endocriniennes associées à l’obésité et au syndrome plurimétabolique, ce type de régulation pourrait contribuer à la baisse des taux circulants d’ApN chez ces patients. Nous avons également montré que le tissu adipeux pouvait autoréguler les taux d’ApN en libérant un facteur déstabilisant les ARNm traduisant cette protéine.
Chez la souris, nous avons récusé TNF-α, pourtant déjà impliqué dans la pathogénie du syndrome plurimétabolique, comme facteur déstabilisateur. Nous avons étayé les données sur l’AMPc, second messager des catécholamines et trouvé que les agonistes des récepteurs β-adrénergiques reproduisant l’inhibition du nucléotide sur l’expression du gène ACRP30 (pendant murin de l’ApN) in vitro et in vivo. Enfin, le traitement à la leptine de souris obèses (ob/ob), a entraîné une restauration partielle des taux d’ARNm ACRP30, habituellement effondrés chez les animaux, et un doublement des taux circulants de cette protéine. Dès lors, nous avons suggéré que la leptine exerçait cet effet par le biais de mécanismes pré et post-traductionnels.
En conclusion, nous avons commencé à élucider la régulation hormonale de l’ApN chez l’homme et la souris. Nos résultats suggèrent que les anomalies endocriniennes associées au syndrome plurimétabolique et/ou à l’obésité pourraient expliquer la diminution des taux circulants d’ApN qui y sont associés. La poursuite des études de régulation de la production de l’adiponectine et la caractérisation des effets de cette dernière, semblent s’inscrire dans la suite logique de ce travail

Gene Expression Regulation --- Adipocytes --- Cardiovascular Diseases

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Central visceral obesity is strongly associated with chronic disorders such as type 2 diabetes, cardiovascular disease and cancer. Adipokines are involved in the pathogenesis of these obesity-linked disorders. However, adipokines secreted by visceral adipose tissue (VAT) are still poorly characterised.
We have searched for novel adipokines secreted by VAT determined whther their secretion was altered in obesity and evaluated the respective contribution of adipocytes vs non-fat (stromal-vascular, SV) cells.
In this context we have identified for the first time 6 adipokines secreted by each cellular fraction of VAT from lean and obese subjects by. These adipokines include 3 chemokines [Growth-Related Oncogen factor (GRO), Regulated upon Activation Normal T cells Expresses and Secreted (RANTES), Macrophage Inflammatory Protein-1β], 1 interleukin (IL-7), 1 tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP-1) and 1 hematopoietic growth factor (thrombopoeitin). Secretion of each adipokine was enhanced in obese subjects with of by pretranslational mechanisms. The higher proportion of macrophages and endothelial cells in VAT of obese subjects may contribute tour findings, as well as changes in intrinsic properties of hypertrophied adipocytes. Accordingly, mRNA concentrations of the majority of these adipokines markedly increased during adipocyte differentiation.
Furthermore we have studied some factors that could change the production of our adipokines : catecholamines (and cAMP), glucocorticoids, insulin and TFNα. We have found that the hormones, normally deregulated in obesity, influenced only moderately the expressions of our adipokines. In contrast, the effects of the TNFα on adipokines were strongly marked. According to these facts we could suggest that the macrophages, the most important source of the TNFα in adipose tissue of obese subjects, may have more impact on the regulation of the adipokines than the hormones studied.
In conclusion, six adipokines were newly identified in VAT. Their expression and secretion were increased in obesity, with a relatively similar contribution of adipocytes and SV cells. Because of their known involvement in cardiovascular disease, cancer or insulin resistance, these adipokines may play a role in obesity-linked adverse health outcomes L’obésité viscérale est un facteur de risque de nombreuses maladies chroniques telles que le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires ou encore certains cancers. Les adipokines sont impliquées dans la pathogénie des co-morbidités de l’obésité. Toutefois, les adipokines secrétées par le tissu adipeux (TA) sont encore très peu étudiées. D’autre part, la contribution des différentes fractions du TA viscéral à cette sécrétion est encore peu connue.
Dans ce cadre, nous avons identifié 6 adipokines, secrétées par le TA viscéral. Ces adipokines comprennent 3 chémokines [Growth-Related Oncogen factor (GRO), Regulated upon Activation Normal T cells Expresses and Secreted (RANTES), Macrophage Inflammatory Protein-1β (MIP-1β)], 1 protéase de la matrice extracellulaire [Tissue Inhibitor of Metalloproteinases (TIMP-1)], 1 facteur hématopoïétique [thrombopoiétine (TPO)] et 1 interleukine (IL-7). La sécrétion de ces adipokines est augmentée chez les sujets obèses par rapport aux minces, et ce à la fois dans les fractions adipocytaire et stomacale vasculaire (FSV) du TA. Nous avons mesuré des variations superposables des ARNm dans les deux fractions : l’augmentation de sécrétion a donc pour origine des mécanismes pré-traductionnels.
Nous avons également mis en évidence une plus grande proportion de macrophages et de cellules endothéliales qui appartiennent à la FSV dans le TA. Ces cellules sont des bonnes sources de cytokines. De concert, elles contribuent à la sécrétion accrue d’adipokines des adipocytes hypertrophiés. En accord avec ces données, l’expression de presque toutes nos adipokines augmente au cours de la différenciation adipocytaire.
Enfin, nous avons étudié certains facteurs (hormones, TNAα) qui peuvent réguler la production de ces adipokines et qui sont susceptibles d’être à l’origine de leur surexpression dans l’obésité. L’effet des hormones est perturbées dans l’obésité (catécholamines, glucocorticoïdes et insuline) est modéré sur l’expression des adipokines. Au contraire, l’effet de TNFα est fortement marqué. Nos données pourraient don suggérer que l’accumulation de macrophages dans le TA des sujets obèse, principale source de TNFα, aurait plus d’impact sur la régulation des adipokines étudiées que les modifications hormonales.
Pour conclure, les 6 adipokines que nous venons d’identifier dans le TA viscéral pourraient stimuler la croissance du TA et également intervenir dans le développement des maladies cardiovasculaires. Elles pourraient aussi favoriser la survenue de la résistance à l’insuline de certaines formes de cancer

Adipose Tissue, White --- Abdominal Fat --- Adipokines --- Obesity --- Adipocytes