Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Antibioticumresistentie bij bacteriën is een wereldwijd probleem, en wordt onder meer veroorzaakt door het terug uitstoten van het antibioticum na de opname door de bacterie. Dit uitstoten wordt gedaan door eiwitten die zich in de membraan, ‘de schil’, van de bacterie bevinden, genaamd transporters. In deze thesis wordt zo’n membraantransporter, LmrP onderzocht, die via een specifiek mechanisme het antibioticum uitstoot. Dit mechanisme bevat een naar-binnen-gerichte open houding voor het opnemen van het antibioticum uit de bacterie, en een naar-buiten-gerichte open houding voor het uitstoten van het antibioticum. De kennis van het mechanisme met de verschillende houdingen wordt gebruikt om informatie over de structurele beweging, ‘plasticiteit’, van het eiwit te verzamelen. Het LmrP werd daartoe specifiek gemerkt met lichtgevende, ‘fluorescente’, probes, elk tegenover elkaar aan de buitenzijde van het eiwit. Op deze manier verandert de afstand tussen deze probes als het transporter eiwit beweegt tussen de naar-buiten-gerichte open en naar-buiten-gerichte gesloten houding. Uit deze veranderende afstand tussen de probes komt een veranderende fluorscentie voort, door interactie tussen de probes als deze dicht bij elkaar zijn. Deze verandering van fluorescentie wordt opgevolgd door een speciale, ‘confocale’, microscoop. Na het verzamelen van deze fluorescentie data bij kamertemperatuur, werden verschillende analysemethoden toegepast op de data. Als resultaat werd er een snelle uitwisseling tussen de open en gesloten houding van het eiwit gevonden, waardoor de aparte open en gesloten houdingen moeilijk te onderscheiden zijn van elkaar. Experimenten bij 10°C en in de aanwezigheid van glycerol werden uitgevoerd met als doel het vertragen van deze snelle uitwisseling. Deze experimenten vertoonden kleine wijzigingen in het gedrag van de uitwisseling, maar geen duidelijke vertraging werd gevonden. Het blokkeren van het LmrP eiwit op specifieke plaatsten gaf enkel meer verschillende houdingen dan verwacht, dus dit werkte ook niet voor het vertragen van de uitwisseling. Als laatste werd het LmrP transporteiwit op andere plaatsen gemerkt, waarbij de afstand tussen de probes in de naar-buiten-gerichte open houding groter was. Deze eerste resultaten gaven opnieuw verschillende houdingen van het eiwit weer, wat doet vermoeden dat er meerdere houdingen zijn dan enkel naar-binnen-gericht open of naar-binnen-gericht gesloten. Verdere analyse van dit LmrP transport eiwit is vereist, eventuele met andere methoden, zoals werken met eiwitten die verankerd worden op een staaldrager, om zo het eiwit gedurende langere tijd te kunnen observeren. Een andere methode is het werken met drie probes in plaats van twee, waarbij een derde probe op een andere plek in het eiwit dan de buitenzijde wordt gezet. Door de interactie van deze derde probe met de andere twee, kan er extra informatie verkregen worden over de houdingen van het eiwit.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Eiwitten spelen een rol in een groot aantal biologische processen en hebben zeer uitlopende functies, zoals bijvoorbeeld het doorgeven van signalen of het verzorgen van chemische reacties en komen daarbij voortdurend met elkaar in contact. Het bestuderen van de interacties tussen eiwitten is daarom van groot belang voor het begrijpen van biologische processen en volledige biologische systemen. FRET (Försterresonantie-energietransfer) is een techniek gebaseerd op fluorescentiemicroscopie die zich uitstekend leent voor de studie van eiwit-eiwit interacties (PPI's). Door de te bestuderen eiwitten te koppelen aan fluorescente eiwitten (FP's), kan de interactie tussen twee eiwitten bestudeerd worden op basis van een mogelijke energie-overdracht van het ene fluorescente eiwit (de 'donor') naar het andere (de 'acceptor') en dit enkel wanneer de eiwitten zich op een afstand kleiner dan tien nanometer bevinden. Onlangs werd in het laboratorium van fotochemie en spectroscopie een nieuwe methode ontwikkeld die het mogelijk maakt om eiwit-eiwit interacties (PPI's) te bestuderen aan de hand van FRET. In dit geval werd de oligomerisatie van het integrase-enzym, een eiwit van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV), het virus dat AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) veroorzaakt, bestudeerd. Integrase stelt HIV in staat om zijn genetisch materiaal in dat van zijn gastheer (een menselijke cel) te brengen. Tijdens de infectie door HIV interageren integrase-enzymen continu met elkaar voor het uitvoeren van hun functie. Het bestuderen van deze interacties kan ons dan ook helpen in het beter begrijpen en mogelijks bestrijden van HIV. Tijdens dit onderzoek werd gesuggereerd dat slechts een deel van de gebruikte donor, genaamd mTFP1, fluorescent was, door het slecht vouwen van het eiwit of de slechte vorming van het chromofoor, het deel van het eiwit verantwoordelijk voor fluorescentie. In het eerste deel van deze thesis wordt dan ook het gebruik van een nieuwe donor, mTurquoise2, geëvalueerd voor de recent ontwikkelde methode. Onze bevindingen tonen aan dat mTurquoise2 minder problemen vertoont bij het vouwen of bij de vorming van het chromofoor en zo meer geschikt is voor deze FRET studies. Tenslotte werd de methode uitgebreid naar een ander virus, het Murine Leukemia Virus (MLV), dat verwant is aan HIV. Virale vectoren afgeleid van MLV werden reeds succesvol gebruikt bij de behandeling van bepaalde ziekten. Ook hier werd mTurquoise2 gebruikt als FRET donor voor het bestuderen van interacties tussen MLV-integrases in viruspartikels met behulp van FRET. De methode werd geoptimaliseerd voor het verkrijgen van een optimaal FRET-signaal. Verder onderzoek zal mogelijks kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van betere retrovirale vectoren afgeleid van het MLV voor klinische gentherapie.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is caused by infection with the human immunodeficiency virus (HIV). The virus is spread over many countries and has become a global pandemic. In 2014, there were 36.9 million people living with HIV of which 1.2 million people died from the consequences of AIDS. There is no cure for HIV, but it can be controlled. To fight the HIV infection, patients are treated with a combination of medication, which reduces the amount of HIV in the body. However, anti HIV medication must be taken every day and can cause unwanted side effects. Furthermore, the virus can develop resistance to the medication, similar as seen with the development of resistance of bacteria to antibiotics. Therefore, scientists keep working hard to know more about HIV, with the goal to reveal new targets for the development of new HIV medication. And maybe one day, a HIV cure. HIV has a spherical structure and it is around a million times smaller than the period at the end of this sentence. It has an outer membrane and within it there is a core built of “capsid” proteins that encapsulates its hereditary information, or genome, made out of RNA. To replicate, HIV releases its capsid core in a cell and converts its RNA genome into DNA. The viral DNA needs to travel through a tiny pore into the cell’s nucleus, where the viral DNA is inserted in the cells chromosome by the viral protein named integrase. Once the viral DNA is implanted, the cell is forced to produce and release new HIV viruses. HIV’s mission accomplished. Since the capsid core is “too big” to pass through the tiny pore, capsid proteins have to detach from the capsid core in a strictly regulated process called uncoating. Not everything is known of the molecular mechanisms underlying this uncoating, including if perhaps some residual capsid proteins stay bound to the virus when it enters the nucleus. Using a fluorescence microscope we can detect and image HIV viruses as little spots inside cells, but only when a fluorescent tag is attached to proteins of the virus. This labeling is performed in the lab by manipulating the genome of the virus. To observe both capsid proteins and integrase proteins, we coupled them with two distinguishable fluorescent tags. It is known that this introduction of a fluorescent tag can negatively influence HIV’s capacity to infect cells. For that reason, 8 groups of viruses, with either a different fluorescent tag or the tag coupled to a different site of the capsid protein, were evaluated with biochemical assays to test their functionality. Only the viruses with the best scores were studied by fluorescence microscopy. A good candidate was virus containing capsid coupled to a tiny green light bulb (GFP) and integrase coupled to a tiny red light bulb (mCherry). By using fluorescence microscopy, we observed the virus in the nucleus of the cell, containing both integrase and capsid. Additionally, by measuring the fluorescence intensity of virus in cells, we found a correlation in the number of capsid and integrase proteins. Further research is needed to confirm these interesting findings of HIV uncoating, which suggest that uncoating in the cytoplasm might be coupled to a decrease in integrase proteins and at least for some viruses capsid proteins could stay bound to the virus when it enters the nucleus.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Employing lifetime analysis together with single-molecule detection techniques opens the door for studying and monitoring protein-protein interactions inside viruses and with cellular structures in real time. It would allow for the detection of FRET during the whole viral infection cycle without the need of photobleaching, which permits the detection of fluorescent proteins using FRET more than once facilitating the real-life tracking of all the interactions. In the case of HIV-1, interactions of integrase (IN) are of special interest as it is known to have an important role for viral DNA integration in the host cell. Throughout this thesis, a method has been developed to perform lifetime analysis of IN attached to eGFP inside an HIV-1 virus. Using the software PAM, lifetimes of eGFP inside HIV-1 viruses in different conditions were obtained using phasor approach and comparing them with the lifetimes obtained utilizing already used methods in the time domain to test in which condition the phasor approach performs better and obtains a correct lifetime. Results show that phasor approach gives an accurate lifetime avoiding the problems of time domain analysis, such as time consuming exponential fitting. Furthermore, it is shown that a photon count of at least 1,000 photons per pixel is necessary.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Fluorescence a phenomenon where certain chemical compounds emit light. A special variant of fluorescence, Föster resonance energy transfer (FRET), can be used to measure the distance between two points on a biomolecule. The shape of molecules can be determined by comparing predicted FRET values to experimentally measured FRET values. The predicted FRET values are based on prior research. The predictions are performed using a computational method known as accessible volume calculations (AV). Due to the simplified nature of AV calculations, the extend to which AV can be used to model experimentally observed values has been brought into question. The research in this thesis compared FRET values measured in experiments to those found via AV calculations. Ultimately, the goal was to find out whether AV calculations can successfully reproduce experimentally observed values. The comparison showed that, while the results of the AV calculations approached those found in experimental measurements, differences between the two remained. The research described in this thesis used a second computational method, molecular dynamics (MD), to investigate the cause of the differences between AV and experimental measurements. The conclusion was made that the differences are due to AV calculations overestimating the flexibility of certain parts of the molecule. Furthermore, AV calculations take into consideration improbable forms of the molecule. These forms are so improbable that they are practically impossible and not observed in experiments.