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Le virus de l'encéphalomyélite murine de Theiler (TMEV) est un Cardiovirus, de la famille Picornaviridae. Les différentes souches du virus sont classées, selon le type de pathologie induite, en souches neuro virulentes et persistantes. Malgré une réponse immunitaire spécifique, les souches persistantes sont capables de persister au niveau de la substance blanche de la moelle épinière. Le virus code deux protéines accessoires : la protéine Leader (L) et la protéine L*. Ces protéines, non requise pour la réplication du virus, confèrent une protection contre la réponse immunitaire innée. La protéine L* (unique parmi la famille Picornaviridae ) est une protéine localisée partiellement dans le cytosol et partiellement dans la membrane externe des mitochondries, avec orientation cytosolique. Il a été montré que la protéine L* facilite l'infection des macrophages et est nécessaire à la persistance du virus in vivo. La fraction cytosolique de L* inhibe l'activité de la RNase L, une enzyme effectrice de la voie IFN, par une interaction directe spécifique à l'espèce. Actuellement, la raison de la localisation mitochondriale de L * est inconnue. L'analyse de virus mutants (et la capacité de L* d'inhiber la RNase L in vitro) suggèrent que la localisation mitochondriale de L* n'est pas nécessaire à l'activité anti-RNase L. Dans ce travail, nous avons étudié si L* pourrait avoir une autre fonction, indépendante de son activité anti-RNase L, liée à sa localisation mitochondriale. Pour ce faire, nous avons d'abord généré des macrophages de la lignée J774.1, déficients pour la RNase L à l'aide du système CRISPR-Cas9 nickase. Ensuite, nous avons produit des virus comportant des mutations dans les régions L et L* : W18 (WT), MD08 (LM60V), TM770 (L*STOP) and TAS, lLM60V+ L*STOP). Deuxièmement, nous avons infecté les macrophages RNase L-/- pour étudier si les virus WT pour L* (VV18 et MD08) ont un avantage réplicatif par rapport aux virus qui codent une L* tronquée (TM770 et TAS). Finalement, nous avons étudié dans les macrophages RNase L-/- différentes fonctions en lien à la mitochondrie, comme le potentiel de membrane mitochondrial et la dynamique mitochondriale (fusion et fission). Ce travail nous a permis de conclure que L* apporte un léger avantage réplicatif en absence de RNase L, augmente la production de pro-IL-lP et, induit une perte de potentiel de membrane suggérant un rôle pro-apoptotique de L*. Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV) is a Cardiovirus member of the Picornaviridae family. TM EV can be divided into neuro virulent and persistent strains. Persistent strains persist in the white matter of the spinal cord of mice despite a specific immune response. TMEV codes for two accessories proteins: the Leader (L) and the L* protein. These proteins are not required for the viral replication, but they confer the capacity to evade the innate immune response. The L* protein, which is only present in TMEV, is partially localized in the cytosol and partially attached into the outer mitochondrial membrane. lt has been shown that L* is essential for viral persistence in macrophages. The cytosolic fraction of L* has the capacity to inhibit the RNase L enzyme by a direct protein-protein interaction characterized by species-specific recognition. RNase L is a well-known enzyme implicated in the cellular antiviral response (and in the IFN induction pathway). Nowadays, the reason of the mitochondrial localization of L* and the function that it might play there are unknown. The capacity of L* to inhibit RNase L in vitro suggest that the mitochondrial fraction of L* is not necessary for the anti-RNase L activity. ln this project, we study if L* could have a function other than RNase L inhibition, in relation ta its mitochondrial localization. Therefore, we firstly produced RNase L-deficient J774.1 macrophages using the CRISPR-Cas9 system (nickase activity). ln parallel, we produced three different mutant viruses with mutations within the L and L* regions and a WT virus: VVlS (WT), MOOS (LM60V), TM770 (L,SToP) and TAS (LM5ov+ L*STOP). Secondly, we infected the RNase L-/- macrophages ta check if viruses with L* WT (VV18 and MOOS) have a replicative advantage in comparison to L* mutant viruses (TM770 and TAS). Finally, we studied in RNase L-/- macrophages different functions related to mitochondria as membrane potential and mitochondrial dynamics (fusion and fission).This work allowed us to conclude that L* provides a slight replicative advantage without RNase L, increases pro-IL-1 production and induces a loss of membrane potential suggesting a pro-apoptotic role of L*.

Mitochondria --- Theilovirus