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Le dogme de la biologie a souvent considéré l’ARN comme un intermédiaire entre l’information génétique contenue dans l’ADN et la protéine qui assure les fonctions biologiques d’un organisme. Cependant, des études ont démontré que 70 % du génome des eucaryotes sont transcrits en ARNs mais seulement 2 % de ces transcrits sont traduits en protéines. Cette observation indique que 98 % des ARNs transcrits ne sont pas traduits en protéines et sont ainsi nommés ARNs non-codants (ARNsnc). Ces derniers sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques, alors que leur dérégulation est associée à diverses pathologies. La majorité de ces transcrits adoptent une structure 3D complexe pour accomplir leur fonction biologique et sont ainsi nommés ARNs structurés (ARNsst). Cependant, à l’heure actuelle, très peu d’ARNsst ont été caractérisés ce qui reflète la complexité de ces molécules ainsi que le manque d’outils actuellement disponibles pour les étudier. Dans ce contexte, le développement de nanobodies (nbs : fragments d’anticorps de camélidés) dirigés contre ces ARNsst vise à faciliter l’étude structurale et fonctionnelle de ces derniers. Préalablement à mon arrivée, une librairie synthétique de nbs a été générée et criblée par phage display contre un ARN qui consistait en la fusion de deux ARNsst d’intérêt : i) BC1 : un ARNst exprimé dans les neurones et dont la structure est inconnue; ii) le ribozyme glmS (ribglms) : un ARNst catalytique dont l’activité est caractérisée et facilement mesurable. L’intérêt d’une telle fusion est d’attester du bon repliement de l’ARN grâce à l’activité catalytique du ribozyme. 

Dans la cadre de mon travail de fin d’étude, nous nous sommes focalisés sur la production, la purification et la caractérisation d’un des nbs sélectionnés lors du criblage de la librairie contre l’ARN fusion BC1-ribglmS. Par interférométrie laser, nous avons démontré que ce nb lie la partie BC1 de l’ARN fusion avec une forte affinité (de l’ordre du nM). Des mesures d’affinité réalisées en présence d’EDTA (qui déstabilise la structure 3D de l’ARN par chélation des ions Mg2+) ont permis de déduire que ce nb interagit avec un élément de structure secondaire de l’ARNst. Les résultats obtenus lors de l’étude de la spécificité du nb, indiquent qu’il est spécifique de l’ARNst car il ne lie pas l’ARNsb, l’ARNdb, l’ADNsb, l’ADNdb ou la BSA. Néanmoins, une interaction entre le nb et différents ARNsst, autres que BC1, a été observée. Nous supposons que ce nb reconnaît donc un/des élément(s) de structure(s) secondaire(s) communs aux différents ARNsst. 

Par des expériences de dichroïsme circulaire, nous avons démontré que la liaison du nb à l’ARN modifie son comportement de dénaturation et renaturation thermique. Enfin, nous avons également mis en évidence que la liaison du nb à l’ARN fusion est associée à une certaine protection de ce dernier vis-à-vis de la dénaturation chimique par traitement au Diméthyl Sulfoxide (DMSO). 

En conclusion, les résultats obtenus dans le cadre de ce travail valident l’approche expérimentale d’obtention de nbs dirigés contre l’ARNst même si leur spécificité reste à optimiser.

nanobody --- ARN structuré --- Sciences du vivant > Biochimie, biophysique & biologie moléculaire

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