Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Tubereuze Sclerose (TSC) is een weesziekte die gekarakteriseerd wordt door de vorming van goedaardige tumoren in verschillende organen. TSC wordt veroorzaakt door een loss-of-function mutatie in het TSC1 of TSC2 gen, welke respectievelijk voor hamartin en tuberin coderen. Door deze mutatie is de mTOR pathway overgeactiveerd wat kan leiden tot onder andere neurologische afwijkingen. Het doel van deze thesis was het verder karakteriseren van het tsc2 ENU gemuteerd zebravismodel met het fenotype van de patiënten in het achterhoofd. Daarbij werd gefocust op de afwijkingen in het centraal zenuwstelsel. Om na te gaan of ons tsc2 zebravismodel een geschikt model was van TSC voor verdere experimenten werd het eerst gevalideerd. Dit gebeurde door met behulp van western blot na te gaan of de mTOR pathway overgeactiveerd was in de mutante zebravis larven. Aansluitend werd een screening uitgevoerd om de morfologie van de verschillende genotypen te karakteriseren. Daaropvolgend werden de hersenen onderzocht aan de hand van twee verschillende methodes: de grootte van het hoofd en de hersenen werd bepaald en in verband gebracht met respectievelijk macrocefalie en megalencefalie. Vervolgens werd de levensvatbaarheid van de larven bepaald aan de hand van een survival curve. Als laatste werd de beweging van de larven onderzocht met behulp van een geautomatiseerd tracking toestel. Dit werd onderzocht omdat een verandering in beweging mogelijk een eerste teken van epileptiforme activiteit is. De Western blot toonde aan dat het tsc2 zebravismodel een geschikt model is om TSC verder te kunnen karakteriseren. Vervolgens kon er aangetoond worden dat de homozygote larven zowel macrocefalie als megalencefalie vertoonden. Er werd ook vastgesteld dat de homozygoten sneller sterven. Als laatste werd ook aangetoond dat de homozygote larven een verschil in locomotor activiteit vertoonden. Dit verschil was te vinden in de totale beweging in het donker, de totale beweging over tijd in een licht/donker cyclus en de beweging na de overgang van licht naar het donker in een licht/donker cyclus. De resultaten tonen aan dat het tsc2 ENU gemuteerd zebravismodel een veelbelovend genetisch model is voor TSC. Het fenotype van de patiënt kan nagebootst worden in de zebravis en andere experimenten kunnen nog worden uitgevoerd om het model verder te karakteriseren. De conclusie is dat de locomotor activiteit een veelbelovende techniek is om epileptiforme activiteit aan te tonen en verder gebruikt kan worden om te screenen voor nieuwe geneesmiddelen.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Over peroxisomen wordt nog veel onderzoek gedaan aangezien er nog veel vragen zijn over deze organellen en hun functies in de cellen. Hun belangrijkste functie is de β-oxidatie van lange ketenvetzuren, vertakte keten vetzuren en poly-onverzadigde vetzuren. Bij de peroxisomale β-oxidatie komt er H2O2 vrij, die wordt afgebroken door catalase tot H2O en O2. Wat echter ontdekt werd, is dat de peroxisomen in de β-cel van de pancreas een heel lage hoeveelheid catalase bevatten. Over de rol van peroxisomen in deze insuline producerende cellen, is echter nog weinig bekend. De eerste doelstelling van deze thesis was om na te gaan of het aantal peroxisomen in β-cellen wijzigt in stresssituaties, zoals bij zwangerschap en blootstelling aan een vetrijk dieet. De peroxisomen van gedispergeerde β-cellen uit geïsoleerde eilandjes van enerzijds zwangere muizen en niet-zwangere muizen en anderzijds muizen op een vetrijk dieet en muizen op een normaal dieet werden gekleurd met anti-PEX14 antistof of anti-PMP70 antistof. Daarna werd het aantal peroxisomen per cel en de grootte van de β-cel vergeleken. Uit de test voor zwangerschap kon besloten worden dat er een verschil is in grootte van de cellen gedurende de zwangerschap. Uit de test met de blootstelling aan een vetrijk dieet bleek dat zowel het aantal peroxisomen als de grootte van de cellen toenam indien de muis op een vetrijk dieet gezet werd. Een tweede vraag die gesteld wordt in deze thesis is wat het belang is van de peroxisomen in insuline producerende cellen. Hiervoor werden RIP-Pex5 knock-out (KO) muizen gegenereerd, waarbij het Pex5 gen uitgeschakeld is in de β-cellen. PEX5 is een peroxine dat belangrijk is voor de import van matrixproteïnes in de peroxisomen. Indien PEX5 uitgeschakeld wordt, kunnen de peroxisomen hun functie niet meer uitoefenen en kunnen veranderingen in deze RIP-Pex5 KO muizen toegeschreven worden aan deze niet-functionerende peroxisomen. Er werd reeds in het verleden gezien dat RIP-Pex5 KO muizen, blootgesteld aan een vetrijk dieet, een afgenomen β-cel massa hebben vergeleken met de controle muizen die hetzelfde voedingspatroon volgden. Om hiervoor een verklaring te vinden, kleurden we coupes van pancreasweefsel met geactiveerd caspase 3. Dit om na te gaan of er meer celdood optreedt, wat het geval niet bleek te zijn. Omdat ook mitochondriën een belangrijke rol spelen in de oxidatie van vetzuren en de vorming van reactieve zuurstofdeeltjes (ROS), behandelden we gedispergeerde cellen van geïsoleerde eilandjes met chemische probes om veranderingen in ROS productie na te gaan, en dit zowel bij laag (5 mM) als hoog (20 mM) glucosegehalte. De kleuring met MSR voor mitochondriale superoxideproductie, toonde geen verschillen tussen KO en controle muizen. De kleuring met CM-H2DCFDA voor cytosolisch superoxide gaf aan dat bij hyperglycemie, er meer cytosolisch superoxide aanwezig is. Er waren echter geen verschillen tussen KO en controle muizen. Ten laatste kleurden we ook voor de mitochondriale membraanpotentiaal met TMRM, dat een goed beeld geeft van mitochondriale defecten. Bij hyperglycemie was de potentiaal gestegen en ook bij KO muizen nam de potentiaal toe.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Lens epithelium derived growth factor (LEDGF) werd in 1998 ontdekt als transcriptiefactor in lens epitheelcellen. Het komt voor in twee splicevarianten. Deze twee varianten kregen de naam LEDGF/p52 en LEDGF/p75, naar hun gewicht in kDa. LEDGF/p75 werd daarna nog een belangrijke rol toegeschreven in HIV-1 replicatie en in de oncogenese, namelijk bij mixed lineage leukemia (MLL). LEDGF/p75 bevat verschillende domeinen. Belangrijk is het integrase bindend domein (IBD) wat een rol speelt bij HIV infectie, omdat het HIV-integrase gaat binden. Belangrijker voor dit onderzoek is een ander domein van LEDGF/p75, het PWWP-domein. Dit domein bevat 93 aminozuren en heeft vooral een functie als epigenetic reader. Deze functie gaat het uitoefenen via zijn hydrofobe holte, die via π-interacties aan chromatine kan binden. Het PWWP-domein heeft specifiek een voorkeur voor het getrimethyleerde lysine 36 op histon 3 (H3K36me3). Hierdoor brengt LEDGF/p75 het HIV-IN en het MLL/menin complex dichter naar het chromatine waardoor deze hun functie kunnen uitoefenen. Bij HIV wordt het IN bij een actieve transcriptieplaats gebracht, bij MLL gaat dit resulteren in meer leukemische transformatie en MLL afhankelijke transcriptie. Deze binding tussen LEDGF/p75 en het chromatine is ons doelwit voor geneesmiddelenontwikkeling. Dit gaan we doen aan de hand van fragment based drug discovery. De interactie tussen het PWWP-domein van LEDGF/p75 en H3K36me3 werd in het verleden al aangetoond. Hierbij werd van 58 fragmenten getest of zij de binding kunnen inhiberen. Deze fragmenten werden gebaseerd op N-methylpyrrolidine, een klein molecule dat als een inhibitor voor methyllysine bindingsplaatsen bekend staat. Op basis van onze data en NMR data over de structuur van het PWWP-domein, werden er 525 moleculen gesynthetiseerd door CISTIM, die in de loop van dit onderzoek getest zullen worden. Hiertoe moeten eerst enkele in vitro testen geoptimaliseerd worden. De eerste test is de AlphaScreen. Hier gaat een optimale test op punt gesteld worden voor een eerste indicatie van een eventuele inhibitorfunctie. De initiële testen worden uitgevoerd met de 525 kandidaat-inhibitoren. Afhankelijk van het resultaat kan deze screen later uitgebreid worden naar meer moleculen. Ook de differential scanning fluorimetry en intrinsieke tryptofaan fluorescentie testen zullen we optimaliseren voor LEDGF/p75. Hier kunnen de inhibitoren dan verder in getest worden om te kijken of ze wel degelijk aan LEDGF/p75 binden en niet aan het histon of aspecifiek. Het uiteindelijke doel is dus om specifieke inhibitoren te ontwikkelen voor de binding tussen LEDGF/p75 en H3K36me3. Mocht dit het geval zijn, kan er in de toekomst getest worden of ze een therapeutische rol van betekenis kunnen spelen bij HIV-1 infectie of kanker.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Tegenwoordig worden er verschillende in vitro testen gebruikt om de intestinale absorptie van nieuwe lipofiele geneesmiddelen te voorspellen. Deze maken meestal gebruik van simpele waterige buffers en negeren grotendeels het complexe intraluminale milieu waardoor de biorelevantie van deze testen in vraag kan worden gesteld. Intestinale vochten bevatten colloïdale structuren die worden gevormd door de aanwezigheid van voornamelijk fosfolipiden, vrije vetzuren, cholesterol, galzouten en monoglyceriden. Deze structuren beïnvloeden zowel de oplosbaarheid als de permeabiliteit van oraal ingenomen geneesmiddelen. Al bekend is dat de oplosbaarheid van lipofiele geneesmiddelen wordt bevorderd door de aanwezigheid van deze structuren. In dit onderzoeksproject werd onderzocht wat de invloed is van de samenstelling van het intestinaal vocht op de permeatie van vier modelgeneesmiddelen: metoprolol, propranolol, darunavir en indomethacine. Om de invloed van galzouten, fosfolipiden, cholesterol, vrije vetzuren en monoglyceriden en hun interacties op geneesmiddelpermeatie te bepalen, werden verschillende gesimuleerde intestinale vochten gemaakt op basis van een Design of Experiments (DoE). Het Ussing Chambers model werd gebruikt om de schijnbare permeabiliteit (Papp) van een ileaal darmsegment van de rat te bepalen voor de modelgeneesmiddelen. Hiertoe werden aan de donorzijde de modelgeneesmiddelen opgelost in de verschillende vochten gebracht en werd de hoeveelheid geneesmiddel in het acceptor compartiment (Cacc) bepaald doorheen de tijd. De insluiting van de modelgeneesmiddelen in de colloïdale structuren werd nagegaan in een dialyse experiment met een cellulosemembraan. In beide experimentele modellen werd de hoeveelheid aan geneesmiddel in de acceptorstalen bepaald met omgekeerde fase HPLC en met ultraviolet absorptie of fluorescentie als detectiemethode. De resultaten van de Ussing Chambers experimenten wezen erop dat voornamelijk lipiden, zoals vrije vetzuren en monoglyceriden, een belangrijke invloed hebben op de initiële insluiting van de geneesmiddelen, met een verminderde permeabiliteit tot gevolg. Ook galzouten hadden een belangrijke maar geneesmiddelafhankelijke invloed: verminderde permeabiliteit voor propranolol en indomethacine, verhoogde permeabiliteit voor metorpolol en darunavir. Deze bevindingen verklaren de resultaten van een eerder onderzoek waarin voor alle 4 geneesmiddelen een permeatie reductie werd vastgesteld in gevoede versus gevaste humane vochten, terwijl dit in gesimuleerde vochten (geen lipiden aanwezig) enkel het geval was voor propranolol en indomethacine. De dialyse gaf het dynamisch karakter van colloïdale insluiting weer. Hieruit bleek dat de geneesmiddelfractie ingesloten in vesikels, gevormd door voornamelijk lipiden, doorheen de tijd worden vrijgezet in aanwezigheid van een sterke flux naar het acceptor compartiment. Daarentegen houden micellen, gevormd door voornamelijk galzouten en fosfolipiden, hun ingesloten fractie vast doorheen de tijd.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Rotavirus en norovirus zijn wereldwijd de twee meest voorkomende oorzaken van ernstige diarree bij kinderen. Jaarlijks zijn rota- en norovirus-infecties verantwoordelijk voor ongeveer 800 000 sterftegevallen bij kinderen jonger dan vijf jaar. Het op de markt brengen van twee rotavirus vaccins deed de mortaliteit dalen, maar deze vaccins zijn echter nog niet overal in gebruik en niet effectief tegen alle verschillende genotypes. Zowel voor rota- als norovirus-infecties zijn er nog geen antivirale middelen beschikbaar, de huidige behandeling bestaat enkel uit rehydratie door middel van oplossingen met glucose of sucrose en elektrolyten. Het hoofddoel van deze thesis is om virus-specifieke moleculen te vinden die antivirale activiteit vertonen tegen zowel rota- als norovirus-infecties. Om krachtige en selectieve inhibitoren van rotavirus replicatie te identificeren en te evalueren werden antivirale assays uitgevoerd met ST3 en SA11 stammen, rotavirussen afkomstig van respectievelijk mensen en apen. Het antivirale effect van de moleculen werd verder bevestigd en gekarakteriseerd door middel van virusopbrengst-reductie-assays en immunofluorescentie analyses. In parallel werd ook de potentiële toxiciteit van de moleculen voor de cellen bepaald. Om het activiteitsspectrum van de moleculen te bestuderen werden verschillende rotavirusstammen geselecteerd, zodat er geverifieerd kon worden of de moleculen antivirale activiteit vertonen tegen alle klinisch relevante stammen. Deze studie resulteerde in de identificatie van een krachtige en selectieve klasse van inhibitoren die ook antivirale activiteit vertonen tegen norovirus-infecties. Deze zullen verder onderzocht worden, onder meer via mechanistische en in vivo studies. Het gebruik van de ‘High Content Imaging’ techniek (welke momenteel toegepast wordt in de onderzoeksgroep) is veelbelovend om het werkingsmechanisme van deze en toekomstige moleculen op te helderen. Tot op heden is er geen robuust in vitro model beschikbaar om het humaan norovirus te bestuderen. Een recente studie heeft aangetoond dat humaan norovirus B cellen kan infecteren. Enkele pogingen om dit in vitro model in het laboratorium op te zetten waren nog niet succesvol. Aangezien het ontwikkelen van een reproduceerbaar in vitro model heel belangrijk is voor het ontdekken en ontwikkelen van nieuwe antivirale middelen tegen norovirus-infecties, is verder onderzoek zeker vereist.