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Ethanolamine-phosphate is the precursor as well as the degrading product of die abundant phospholpid phosphatidylethanolamine Ethanolamine-phosphate is metabolised into acetaldehyde, ammonia and inorganic phosphate by an enzyme using pyridoxal-phosphate as a co-factor, but with unknown molecular identity. A similar reaction happens during the metabolism of hydroxylysine-phosphate, an anima acid specific to colIagen. The molecular identification of both the kinase that phosphorylates hydoxylysine and of the lyase that degrades the phosphorylation product is also unknown. The family of mammalian aminotransferases class III has five members that ail bind pyridoxa1-phosphate Three of these catalyse the transfer of a terminal amine — the one in ornithine (OAT), die one in γ-aminobutyrate (GABA transaminase) and die one in glycine (AGXT2) — onto α-ketoacids The roIe of the other two proteins in this family (AGXT2L I and AGXT2L2, that are closest to AGXT2) has not been identified yet The SNP (single nucleotide polymorphism) data bank suggests the presence of a frequent premature STOP codon in AGXT2L 1. The existence in the population of a number of individuals that are high excretors of β-aminoisobutyrate in the urine lead us to suggest that AGXT2LI could correspond to the β -aminoisobutyrate transaminase. This is our first working hypothesis that we tested, Furthermore, the results from sequence comparisons showed that the human sequences of AGXT2LI and AGXT2L2 resemble the C-terminal domain of bacterial bi-functional proteins of unknown catalytic activity. The N-terminal region of these bacterial proteins belong to die super-family of aminoglycosides kinases which are enzymes that commonly catalyse the phosphorylation of a hydroxyl group that is close ta an amine. In the genome of vertebrates, there is a homologue of this gene called AGPI-TDI (aminoglycoside phosphotransferase domain containing 1), These observations lead us to propose as a second hypothesis, that AGPHDI is a kinase that phosphorylates hydroxylysine to hydroxylysinephosphate, which ca, then be metabolised by either AGXT2LI or AGXT2L2. The function of die other of the two proteins will be to metabolise ethanolamine-phosphate. In order to test our hypothesis we amplified and cloned the human cDNAs of AGPHDI, AGXT2LI and AGXT2L2. We expressed and purified the recombinant His-tagged proteins from Escherichia coli soluble protein extracts. Neither, AGXT2L1 nor AGXT2L2 were active as transaminases with β -alanine or β -aminoisobutyrate. However, AGXT2L I converted ethanolamine-phosphate to acetaldehyde, inorganic phosphate and ammonia while AGXT2L2 did not. Furthermore, AGPHD1 used ATP to phosphorylate hydroylysine and AGXT2L2 made ammonia and inorganic phosphate from hydroxylysine-phosphate. In conclusion, we have molecularly identified the two enzymes presently known that catalyse the double elimination reaction of phosphate and ammonia. The observation that they belong to a family of aminotransferases suggests that they have a common transaminase ancestor. These identifications could help to understand and to identify the molecular defect in ethanolaminuria and hydroxylysinuria or phosphohydroxylysinuria L’éthanolamine-phosphate est un précurseur d’un phospholipide abondant, la phosphatidyléthanolamine, mais également un produit de dégradation de celle-ci. Elle est métabolisée en acétaldéhyde, ammoniac et phosphate inorganique par une enzyme utilisant le pyridoxal-phosphate comme cofacteur, mais dont l’identité moléculaire est inconnue. Une réaction semblable se déroule avec l’hydroxylysine-phosphate, intermédiaire dans la dégradation de l’hydroxylysine, un acide aminé spécifique du collagène. L’identité moléculaire de la kinase qui phosphoryle l’hydroxylysine et celle de la lyase qui dégrade son produit de phosphorylation sont également inconnues. La famille des aminotransférases de classe III mammaliennes comprend cinq membres qui tous lient le pyridoxal-phosphate. Trois d’entre elles catalysent le transfert d’une amine terminale — celle de l’ornithine (OAT), du γ-aminobutyrate (GABA transaminase) et de la glycine (AGXT2) — sur des α-cétoacides. La fonction des deux autres protéines de cette famille (AGXT2L1 et AGXT2L2, qui sont assez proches d’AGXT2) n’est pas identifiée. Les banques de données de SNP (single nucleotide polymorphisms) suggèrent l’existence fréquente d’un codon STOP prématuré dans la séquence d’AGXT2L1. L’existence dans la population d’une proportion importante d’individus qui excrètent du β-aminoisobutyrate dans leurs urines nous a fait penser qu’AGXT2L1 pourrait être la β- aminoisobutyrate transaminase. Ceci est la première hypothèse de travail que nous avons testé. Par ailleurs, des résultats de comparaison de séquences montrent que les séquences humaines d’AGXT2L1 et d’AGXT2L2 sont proches du domaine C-terminal de protéines bactériennes «bifonctionnelles », dont on igncire encore quelles réactions elles catalysent. Le domaine N-terminal de ces protéines bactériennes appartient à la superfamille des aminoglycosides kinases, enzymes catalysant généralement la phosphorylation d’un groupement hydroxyle proche d’une amine. On trouve, dans les génomes de vertébrés, un gène codant une protéine homologue à ce domaine N-terminal. Ce gène est appelé AGPHD1 (aminoglycoside phosphotransferase domain 1). Ces observations nous ont amené à formuler une deuxième hypothèse, à savoir qu’AGPHDl sert à phosphoryler l’hydroxylysine en hydroxylysine-phosphate, et que celle-ci est alors métabolisée par AGXT2L1 ou AGXT2L2. L’autre de ces deux protéines servirait à métaboliser l’éthanolamine-phosphate. Pour tester ces hypothèses nous avons amplifié et cloné les ADNc humains d’AGPHDl, d’AGXT2L1 et d’AGXT2L2. Les protéines correspondantes, munies d’une étiquette de six histidines ont été exprimées chez Escherichia cou et purifiées à l’aide d’une colonne d’affinité pour les polyhistidines. Ni AGXT2L1, ni AGXT2L2 n’ont d’activité transaminase sur le β-aminoisobutyrate ou la β-alanine. Par contre, AGXT2L 1 convertit l’éthanolamine-phosphate en acétaldéhyde, phosphate inorganique et ammoniac ; AGXT2L2 n’a pas cette activité. De plus, AGPHD1 phosphoryle l’hydroxylysine aux dépens d’ATP. Enfin, AGXT2L2 forme de l’ammoniac et du phosphate inorganique à partir d’hydroxylysinephosphate, mais non d ‘éthanolamine-phosphate. En conclusion, nous avons identifié moléculairement les deux seules enzymes connues actuellement qui catalysent une double réaction d’élimination de phosphate et d’ammoniac. Leur appartenance à une famille d’aminotransférases suggère qu’elles ont évolué à partir d’une transaminase ancestrale. L’identification de ces deux enzymes, ainsi que de l’hydroxylysine kinase, devrait faciliter la compréhension de désordres métaboliques dans lesquels 1’ éthanolamine, l’hydroxylysine ou leurs dérivés phosphorylés sont excrétés en excès.

Phosphatidylethanolamines --- Pyridoxal Phosphate --- Polymorphism, Single Nucleotide --- Kanamycin Kinase --- Alanine --- Enzymes