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Telomeres are structures made of DNA and proteins which protect chromosome ends. The hTERT catalytic subunit of telomerase, the enzyme that maintains telomeres, is not expressed in somatic cells. Therefore, forced divisions of normal cells induces progressive telomere shortening, resulting in p53 activation and cell cycle arrest called replicative senescence or Ml. When grown in culture, some cells do not reach Ml but are characterized by an MO premature senescence arrest that is probably a consequence of pI6/CDKN2A activation. ln addition, during tumorigenesis, cells with an activated oncogene, like Ras, also display premature senescence. Our laboratory is studying the impact of cellular senescence on DNA methylation level in human cells. Indeed, it has been proposed that cellular senescence may be one of the first steps of tumorigenesis, a process associated with a global decrease in DNA methylation. Previous results in the lab had shown a transient decrease in DNA methylation level of fibroblasts entering Ml replicative senescence in culture. We reproduced this experiment in normal melanocytes. We evaluated global DNA methylation level by a quantitative PCR approach measuring pericentromeric DNA Sat2 methylation and by measuring expression level of MAGE genes, normally repressed by promoter methylation. Our results suggest that DNA demethylation may occur during Ml senescence. On the other hand, we observed a premature entry into MO senescence of a subset of melanocytes. Some cells emerged from MO and started to proliferate again through apparent activation of telomerase. Their genome was not demethylated. We further observed Sat2 DNA demethylation in fibroblasts subjected to RasVl2 oncogene-induced senescence. We could not test the impact of RasVl2 in melanocytes that turned out to be highly sensitive to transductions. To circumvent this problem, we analysed MAGE, hTERT and p2I expression in cDNA samples collected from nevi and melanoma as nevi were proposed to correspond to pre-tumoral senescent stage of melanoma. Our results suggest the existence of an anti-correlation between the expression of hTERT on one hand and ofp2I/MAGE on the other hand. Together, our results led us to propose a model in which wc postulate that two distinct immortalization pathways may lead to melanoma formation: MO senescence bypass associated with the apparently « easy » activation of telomerase without DNA demethylation process or the passage through an Ml senescence step that might be associated with DNA demethylation. We also initiated the study of DNA methylation ID mammary epithelial cells. Preliminary results are shown. Les télomères sont composés d’ADN et de protéines protégeant les extrémités chromosomiques. La sous-unité catalytique hTERT de la télomérase, l’enzyme de maintien des télomères, n’est pas exprimée dans les cellules somatiques. Une division forcée de ces cellules entraîne donc un raccourcissement de l’ADN télomérique au fil des divisions cellulaires, aboutissant à l’activation de p53 et l’arrêt de prolifération cellulaire appelé sénescence réplicative ou Ml. Certaines cellules en culture présentent une sénescence prématurée MO avant même d’avoir atteint Ml. Celle-ci dépendrait sans doute de l’activation de p] 6/CDKN2A. En outre, lors de la tumorigenèse, les cellules ayant activé un oncogène, tel que Ras, présentent également une sénescence prématurée. Le laboratoire s’ intéresse à l’impact de la sénescence cellulaire sur le niveau de méthylation de l’ADN de cellules humaines En effet, on pense que la sénescence pourrait être une des premières étapes de la tumorigenèse, un processus caractérisé par une déméthylation globale du génome. Des premiers résultats du laboratoire avaient mis en évidence une baisse transitoire du niveau de méthylation de l’ADN dans des fibroblastes lors de l’entrée en sénescence réplicative Ml. Nous avons reproduit cette étude dans des mélanocytes normaux. Nous avons évalué l’état global de méthylation grâce à une PCR permettant de quantifier la méthylation de l’ADN du locus Sat2 péricentromérique et à la mesure de l’expression des gènes de la famille MAGE, normalement réprimés par méthylation de leur promoteur. Nos résultats suggèrent qu’une déméthylation de l’ADN pourrait avoir lieu en sénescence Ml. D’autre part, nous avons observé une sénescence prémature MO de certains mélanocytes. Des cellules ont émergé de cet état MO et recommencé à proliférer en ayant apparemment activé la télomérase. Leur génome ne présentait pas de déméthylation de l’ADN. Nous avons également observé une baisse de la méthylation de l’ADN Sat2 de fibroblastes suite à la sénescence induite par l’oncogène RasV 12. Nous n’avons pas pu tester l’impact de RasVl2 dans les mélanocytes, hypersensibles à la transduction. Pour pallier ce problème, nous avons analysé l’expression des gènes MAGE, hTERT et p2] dans des échantillons d’ADNc obtenus à partir de naevi et de mélanomes, les naevi étant décrits comme correspondants au stade de sénescence pré-tumorale des mélanomes. Nos résultats suggèrent une anti-corrélation entre l’expression d’hTERT d’une part et de p2]/MAGE d’autre part. Ensemble, nos résultats nous ont permis de proposer un modèle qui postule que deux voies d’immortalisation distinctes pourraient mener à l’apparition de mélanomes : le bypass d’une sénescence MO, associée à l’activation apparemment «aisée» de la télomérase sans processus de déméthylation de l’ADN ou le passage par une phase de sénescence Ml qui serait associée à une déméthylation de l’ADN. Nous avons également initié l’étude de la méthylation de l’ADN de cellules épithéliales mammaires. Les résultats préliminaires sont présentés

telomere --- Telomerase --- Cell Aging --- Polymerase Chain Reaction --- DNA Methylation --- Melanocytes --- Humans