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The vascular injuries are responsible for most of the morbidity and mortality observed in diabetics. Chronic hyperglycemia is clearly recognized as the main culprit. Oxidative stress is an important pathogenic factor. It causes structural and functional alterations of endothelial cells. In this work, we focused on the molecular mechanisms. By which high glucose concentrations result in structural changes of the endothelium. These changes are the result of a rearrangement of the actin cytoskeleton and an increase in its contractility. In healthy endothelium, a dense network of cortical actin ensure the maintenance of intercellular adhesion in the endothelial monolayer that forms in this way a dynamic semipermeable barrier between the circulation and surrounding tissues. The contraction of the actin cytoskeleton decreases the adhesion between cells and therefore increases trans-endothelial permeability. Among the physiological agents that can affect vascular permeability, thrombin is an interesting case. Indeed, this protease is not only involved in controlling blood clotting. It can also modulate the function and structure of the endothelium. In physiological conditions, its effect on concentration of the cell cytoskeleton is offset by the massive release of NO (nitric oxide) which results in relaxation of underlying smooth muscle. This balance between contraction-relaxation ensures the integrity of the endothelial barrier. In contrast, in pathological conditions (diabetes or sepsis), the resulting oxidative stress causes a decrease in the availability of NO and breaks the balance in favour of cell contraction. The vascular permeability is dramatically increased (pro-coagulant state of the endothelium and leakage of plasma into the perivascular space).
The molecular mechanisms by which thrombin exerts its effect on the structure of endothelium are similar to those of hyperglycemia and involve the phosphorylation of several cytoskeleton targets. We focused on two axes of regulation controlling contractility and actin polymerisation, respectively: the axis RhoA/ROK (Rho-associated protein kinase) and the axis p38MAPK/HSP27. The activation of these signalling pathways by thrombin also induces the activation of the AMP-activated kinase (AMPK) in the endothelial cells. The importance of this activation in the control of the architecture of the endothelial cells has been suggested. We also investigated the potential interference of this protein kinase with RhoA and HSP27 signalling.
Our results show that high glucose activates RhoA/MLC axis and potentiates the effects of thrombin, at least on RhoA. Phosphorylation of HSP27 is less sensitive to extracellular glucose concentration. We also show that AMPK, activated in response to thrombin, prevents RhoA/MLC activation and phosphorylation of HSP27. We propose that the activation of eNOS and NO production may be the mechanism by which AMPK inhibits phosphorylation of HSP27 is not yet understood Les lésions vasculaires sont responsables de l’essentiel de la morbidité et de la mortalité observées chez les diabétiques. L’hyperglycémie chronique est clairement reconnue comme le coupable principal. Le stress oxydatif en est un élément pathogénique important. Il est à l’origine des altérations fonctionnelles et structurelles des cellules endothéliales. Dans ce travail, nous nous sommes focalisés sur les mécanismes moléculaires par lesquels de hautes concentrations en glucose entraînent des modifications structurelles de l’endothélium. Ces modifications sont le résultat d’un réarrangement du cytosquelette d’actine et d’une augmentation de sa contractilité. Dans l’endothélium sain, un réseau dense d’actine corticale assure le maintien de l’adhésion inter-cellulaire au sein de la monocouche endothéliale qui forme de cette façon une barrière dynamique semi-perméable entre la circulation et les tissus environnants. La contraction du cytosquelette d’actine diminue l’adhésion des cellules entre elles et augmente par conséquent la perméabilité trans-endothéliale. Parmi les agents physiologiques capables d’affecter la perméabilité vasculaire, la thrombine est un cas intéressant. En effet, cette protéase n’est pas seulement impliquée dans le contrôle de la l’endothélium. En condition physiologique, son effet sur la contractilité du cytosquelette cellulaire est compensé par la libération massive de NO (monoxyde d’azote) qu’elle entraîne et qui induit la relaxation du muscle lisse sous-jacent. Cet équilibre contraction-relaxation assure l’intégrité de la barrière endothéliale. Par contre, en condition pathologique (diabète ou sepsis), le stress oxydatif qui en découle provoque une diminution de la disponibilité du NO et rompt l’équilibre en faveur de la contraction cellulaire. La perméabilité vasculaire est dramatiquement augmentée (état pro-coagulant de l’endothélium et fuite de plasma dans l’espace péri-vasculaire).
Les mécanismes moléculaires par lesquels la thrombine exerce son effet sur la structure de l’endothélium sont similaires à ceux de l’hyperglycémie et impliquent la phosphorylation de plusieurs éléments de contrôle du cytosquelette. Nous nous sommes intéressés à deux axes de régulation, contrôlant respectivement la contractilité et la polymérisation de l’actine : l’axe RhoA/ROK (Rho-associated protein kinase) et l’axe p38MAPK/HSP27. L’activation de ces deux voies de signalisation par la thrombine induit également l’activation de l’AMP-activated protein kinase (AMPK) dans les cellules endothéliales. L’importance de cette activation dans le contrôle de l’architecture de la cellule endothéliale a été suggérée. Nous avons également investigué l’interférence potentielle de cette protéine kinase avec les axes de signalisation étudiés.
Nos résultats montrent que le haut glucose active l’axe RhoA/MLC et potentialise les effets de la thrombine, au moins sur RhoA. La phosphorylation d’HSP27 est moins sensible à la concentration de glucose extracellulaire. Nous montrons également que l’AMPK, activée en réponse à la thrombine, s’oppose à l’activation de RhoA/MLC et à la phosphorylation d’HSP27. Nous proposons que l’activation de eNOS et la production de NO pourrait être le mécanisme par lequel l’AMPK contrôle l’activité de RhoA dans les cellules endothéliales. Le mécanisme par lequel l’AMPK inhibe la phosphorylation d’HSP27 n’est pas encore élucidé

Thrombin --- Diabetes Mellitus --- AMP-activated protein kinases --- Hyperglycemia --- Oxidative Stress --- Endothelial Cells