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Trypanosoma brucei is a protozoan organism that is responsible for sleeping sickness. It spends part of its cycle in the blood of mammals. In the bloodstream form, the parasite’s ATP production is entirely dependent on glycolysis which occurs in a peroxisome-like organelle, called glycosome. Inhibition of glycolytic activity leads rapidly to the death of the parasite. The T. brucei glycosomal glycarelgehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) has been identified as a promising target for the design of new drugs. Indeed, comparison of the crystal structures f human and T. brucei GAPDH revealed differences around the binding pocket for the adenosyl moiety of the bound cofactor NAD+.
Recently, an adenosine analogue has been synthesized as a selective inhibitor of the T. brucei GAPDH. This compound inhibits the enzyme in the submicromolar range and has no effect on human GAPDH. When tested on cultured cells, the adenosine analogue killed T. brucei but didn’t affect growth of human fibroblasts. The objective of the study presented here was to establish that GAPDH is really the in vivo target of the inhibitor by testing its effect on T. brucei cells in which the endogenous enzyme was reduced and a mutated enzyme, made insusceptible to the inhibitor, was over-expressed.
First, we constructed a T. brucei cell line which a reduction of the endogenous GAPDH expression by the mechanism of RNA interference upon its induction by tetracycline. By Western blots and RT-PCR, we showed the decrease of the expression of the enzyme and its mRNA, respectively. Growth curves show that cells begin to die 72 h after induction.
Second, using the T. brucei cell line in which GAPDH could be targeted by RNAi, we created two daughter cells line : one also over-expressing the wild-type GAPDH and the other one over-expressing a mutated GAPDH insensitive to the inhibitor. Growth curves show that our clones can stay alive after induction of the RNAi and the endogenous enzyme. This explains probably the bad growth and the fact that we don’t observe differences between our two lines when they are incubated in the presence of the inhibitor.
Integration of a second gene copy of mutated gene in the genome of our cells lines will probably be necessary for getting around this problem Trypanosoma brucei est l’agent responsable de la maladie du sommeil. C’est un organisme protozoaire dont une partie du cycle de vie se déroule dans le sang des mammifères. Sous cette forme sanguicole, sa production d’ATP est entièrement dépendante de la glycolyse, qui a lieu dans un organite spécialisé, le glycosome. L’inhibition de la glycolyse aboutit rapidement à la mort du parasite. La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) de T. brucei a été identifiée comme une cible très prometteuse pour la conception de nouveaux médicaments. En effet, la comparaison de sa structure tridimensionnelle avec celle de l’enzyme humaine montre d’importantes différences au niveau du site de fixation de son cofacteur, le NAD+.
Récemment, un analogue de l’adénosine a été synthétisé comme inhibiteur sélectif de la GAPDH de T. brucei. Ce composé inhibe l’enzyme purifiée de T. brucei à des concentrations submicromolaires sans avoir d’effet sur l’enzyme humaine. Testé sur des cellules de culture, il tue les trypanosomes sans affecter les fibroblastes humain. Nous voulons maintenant vérifier que la GAPDH est bien la cible de cet analogue de l’adénosine in vivo en testant son effet sur des cellules de T. brucei dont l’enzyme endogène aurait été fortement réduite et une enzyme mutée, insensible à l’inhibiteur, surexprimée.
Dans un premier temps, nous avons donc construit une lignée cellulaire de T. brucei, qui, par le mécanisme de l’ARNi, montre une diminution de l’expression de la GAPDH endogène lorsqu’elle est induite par la tétracycline. Nous avons pu montrer, par Western blot et RT-PCR, la diminution respective de l’expression de la GAPDH et de l’ARNm de cette protéine. Des courbes de croissance montrent qu’après 72h d’induction, les cellules commencent à mourir.
Ensuite, à partir de cette lignée cellulaire de T. brucei où la GAPDH est ciblée par l’ARNi, nous avons créé deux autres lignées : l’une surexprimant une GAPDH sauvage et l’autre une GAPDH mutée qui est insensible à l’inhibiteur. Les courbes de croissances montrent que nos clones parviennent à se maintenir en vie après induction à la fois de l’ARNi et de la surexpression mais la croissance est très affectée. Des Western blots ont permis de constater que la quantité de GARDH surexprimée est loin de compenser la diminution de l’enzyme endogène, ce qui explique probablement cette mauvaise croissance, mais également le fait que nous n’observons pas de différences entre nos 2 lignées quand elles sont incubées en présence de l’inhibiteur.
L’intégration dans le génome de nos lignées cellulaires d’une seconde copie des gènes sera probablement nécessaire pour pallier à cette situation.

Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenases --- Trypanosoma brucei brucei

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