Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Dankzij het “human genome project” en de recente ontwikkelingen in het “proteomics” domein zijn onze inzichten in de onderliggende controlemechanismen van levende processen sterk toegenomen. Deze informatie moet ons in de toekomst in staat stellen om aandoeningen op een oorzakelijke wijze en in een vroege ontwikkelingsfase te behandelen. Het DNA, de drager van de genetische informatie, blijkt hiervoor een geschikte receptor te zijn met ongelimiteerde mogelijkheden. Moleculen die in staat zijn om op een sequentie-selectieve manier DNA te binden, kunnen gebruikt worden voor de behandeling van kanker, genetische afwijkingen en infectieziekten. Gedurende de laatste jaren zijn heel wat DNA bindende moleculen ontwikkeld, met recentelijk de ontwikkeling van peptide nucleïnezuren die in staat zijn om in vivo de expressie van genen om een selectieve manier te inhiberen. Ondanks deze positieve resultaten worden de meeste concepten echter geconfronteerd met problemen als aspecifieke binding, slechte cellulaire penetratie en een lage biologische stabiliteit. Omwille van deze tekortkomingen en het grote potentieel van het DNA als macroreceptor, dient de zoektocht naar nieuwe DNA bindende moleculen verdergezet te worden. Inonze zoektocht naar nieuwe sequentie selectieve DNA bindende liganden werd gekozen om korte oligopeptiden te ontwikkelen naar analogie met de welliswaar grotere natuurlijke DNA-bindende proteïnen. Vaste fase oligopeptide synthese in combinatie met een snelle ethidium bromide verdringingstest (96-kuipjes plaat formaat) blijkt een geschikte strategie te zijn om op een accurate manier DNA-bindende oligopeptiden te ontwikkelen. Het geselecteerde DNA bindende oligopeptide Ac-Arg-Ual-Sar-Chi-Chi-Chi-Arg-NH2, met een DNA bindingsconstante van 2.0 x 10-4 M, werd verder geoptimaliseerd door selectieve substitutie van de Ual en Sar posities met nieuwe, commercieel beschikbare aminozuren. Algemeen kunnen we stellen dat, met uitzondering voor het positief geladen lysine, hydrofobe aminozuren de beste bindingsresultaten gaven. Het oligopeptide Ac-Arg-Lys-Phe(pNO2)-Chi-Chi-Chi-Arg-NH2 vertoont hierbij een bindingsaffiniteit van 1.1 x 10-5 M. De DNA bindingsaffiniteit van het reeds geoptimaliseerde oligopeptide Ac-Arg-Cbg-Cha-Chi-Chi-Tal-Arg-NH2 (Kd = 3.49 x 10-5 M) voor deze twee aminozuur posities werd verder verbeterd door optimalisatie van de bindingssequentie. Dit oligopeptide vertoonde hierbij een selectieve affiniteit voor de sequenties (5’-ATCCT-‘3) en (5’-TTCCT-‘3) met een bindingsconstante van 2.0 x 10-5 M. Verdere verlenging van de oligopeptiden bleek echter geen verdere verbetering te geven van de bindingsaffiniteit voor dsDNA. Hieruit werd besloten dat een maximale bindingsaffiniteit voor dsDNA met onze heptapeptiden bereikt werd. Om de bindingsaffiniteit en sequentie selectiviteit verder te optimaliseren werden hybride moleculen ontwikkeld door koppeling van de oligopeptiden met de DNA intercalator acridine. Door gebruik te maken van het lysine gederivatizeerde acridine, Lys(Acr), konden peptide-acridine -, peptide-bisacridine - en dipeptide-acridine conjugaten gesynthetiseerd worden naar analogie met bestaande DNA bindende moleculen. Deze moleculen warentevens ook interessant voor evaluatie van hun potentiële antitumorale activiteit. Koppeling van de nieuwe acridine intercalerende eenheid bleek inderdaad een positief effect te hebben op de bindingsaffiniteit voor dsDNA. De toename in bindingsaffiniteit bleek echter afhankelijk te zijn van de initiële affiniteit van de oligopeptiden. Door koppeling van de nieuwe acridine eenheid konden bindingsaffiniteiten bereikt worden van 1 tot 3 x 10-5 M. Bovendien vertonen deze peptide-acridine conjugaten een interessante antitumorale activiteit tegen de humane myeloïde leukemie cellijn K-562, waarbij het conjugaat Ac-Lys(Acr)-β-Ala-Gly-Arg-Cbg-Cha-Chi-Chi-Tal-Arg-NH2 een IC50 vertoont van 1 μM. Koppeling van een tweede acridine eenheid met de synthese van peptide-bisacridine conjugaten veroorzaakte geen significante verhoging van de DNA bindingsaffiniteit. Tenslotte werd een reeks van dipeptide-acridine conjugaten ontwikkeld naar analogie met het natuurlijk voorkomende actinomycine D. Deze dipeptide-acridine conjugaten vertoonden een sterke DNA binding met bindingsconstanten tot 6.4 x 10-6 M. Dit is een verbetering van de bindingsaffiniteit van het start oligopeptide Ac-Arg-Ual-Sar-Chi-Chi-Chi-Arg-NH2 met een factor 30. DNase I footprinting experimenten toonden echter aspecifieke DNA binding. Deze dipeptide-acridine conjugaten vertonen eveneens een sterke, selectieve antitumorale activiteit tegen de K-562 cellijn, waarbij het conjugaat Ac-Arg-Tal-Chi-Chi-Cbg-Cha-Arg-Gly-Lys(Acr)-6-Ahx-Arg-Ual-Sar-Chi-Chi-Chi-Arg-NH2 een IC50 heeft van 2 μM. Daarom kunnen ze beschouwd worden als een potentieel selectief alternatief voor actinomycine D. Omdat er een relatie blijkt te bestaan tussen de antitumorale activiteit en het lipofiele karakter van de conjugaten, hebben we gepostuleerd dat een hogere lipofiliciteit de cellulaire opname in de leukemie cellen bevordert. Deze goede en selectieve antitumorale activiteit van de oligopeptide-acridine conjugaten zorgt ervoor dat verder onderzoek zich zal toespitsen in het vastleggen van een structuur-activiteitsrelatie en het onderzoek naar de onderliggende antitumorale werkingsmechanismen. During the last two decades, insights into the underlying mechanisms of life processes have grown dramatically. This information will allow us in the future to design drugs capable of stopping diseases in an early stage of development. From the moment DNA was considered as a macromolecular receptor on which molecules could exert their farmacological effects, the field of the “antigene strategy” was born. Creating compounds that recognize specific DNA sequences is a central goal in the development of DNA-targeted drugs. Such antigene agents may be able to manipulate transcription of individual genes and, hence, are potentially useful for the treatment of cancers as well as genetic and infectious diseases. During the years, lots of progress has been made in the design of DNA targeting drugs, and more recently the design of the first molecules capable of in vivo regulation of gene expression in a very specific manner have been discovered. In spite of this success, most approaches are still confronted with problems as aspecific recognition, low ability to penetrate cells and low biological stability. Due to the drawbacks of these approaches and the great potential of DNA as a receptor, the search for new DNA-binding compounds needs to be continued. Searching for gene–regulating compounds, the design of short unnatural oligopeptides capable of binding DNA in analogy with natural DNA-binding proteins seemed to be very applicable. A solid-phase peptide synthesis approach in combination with a high throughput fluorescent intercalator displacement assay, turned out to be an accurate strategy to develop these dsDNA-binding oligopeptides. Starting from the oligopeptide Ac-Arg-Ual-Sar-Chi-Chi-Chi-Arg-NH2, which displayed a moderate DNA-binding affinity of 2.0 x 10-4 M, we were able to increase the DNA-binding affinity by selective substitution of the Ual and Sar positions with new, commercially available amino acid building blocks. From these results, in generala clear preference was observed for hydrophobic amino acids, with exception of Lys. The oligopeptide Ac-Arg-Lys-Phe(pNO2)-Chi-Chi-Chi-Arg-NH2 binds DNA with an affinity of 1.1 x 10-5 M. As the oligopeptide Ac-Arg-Cbg-Cha-Chi-Chi-Tal-Arg-NH2 was already optimized for the Ual-Sar sequence, a new strategy had to be performed to further optimize its DNA binding affinity. This time, the DNA target sequence was optimized using a hairpin library approach. Using this approach we were able to develop anoligopeptide with sequence-selectivity for the five bp sequences (5’-ATCCT-‘3) and (5’TTCCT-‘3). Unfortunately, the binding benefit remained limited with only a 2-fold increase in binding affinity up to 2 x 10-5 M for both DNA sequences. Further elongation of the oligopeptide sequences with one amino acid could not improve the DNA binding affinity. From these results, we realized that a maximum binding affinity with these short heptapeptides for dsDNA was reached. In order to try to further improve the binding affinity and sequence-selectivity of our oligopeptides, the introduction of an intercalative binding mechanism was very demanding. At the same time these compounds would be interesting for analysis of their potential antitumor activity. With the synthesis of a new lysine based acridine unit, Lys(Acr), different oligopeptide-acridine conjugates (PACs, PbACs and DACs) could be designed using known hybrid molecules as model compounds. Coupling of the new acridine unit with the synthesis of PACs, turned out to have a positive effect on the binding affinity of the oligopeptides. However, the binding benefit was dependant on the initial binding affinity of the lead peptides with a maximum binding affinity in the range of 1 to 3 x 10-5 M. Antitumor tests with the PACs against the K-562 and HT-29 cell lines, revealed an interesting selective cytotoxiciy against the leukemia cell line K-562. The PAC Ac-Lys(Acr)-β-Ala-Gly-Arg-Cbg-Cha-Chi-Chi-Tal-Arg-NH2 displayed an IC50 of 1 μM. Coupling of a second acridine unit didn’t give any significant binding benefit. As for the PACs, the PbACs showed no activity against the HT-29 cell line. Finally, DACs were synthesized using ACTD as a model compound. These DACs showed strong DNA binding affinities up to 6.4 x 10-6 M, which is a 30-fold enhancement of the binding affinity in comparison the the starting lead peptide Ac-Arg-Ual-Sar-Chi-Chi-Chi-Arg-NH2 (Kd = 2.0 x 10-4 M). Unfortunately, no sequence-selectivity was observed. Antitumor tests revealed a potent and selective cytotoxicity for the DAC Ac-Arg-Tal-Chi-Chi-Cbg-Cha-Arg-Gly-Lys(Acr)-6-Ahx-Arg-Ual-Sar-Chi-Chi-Chi-Arg-NH2 with an IC50 of 2 μM. Therefore, these DACs can be considered as potent, selective alternatives for ACTD. Until now, the underlying mechanism responsible for the antitumor activity remains uncertain. However, it is observed that more lipophilic conjugates show a more potent antitumor activity. Therfore we hypothesized that an increased lipophilicity improves the diffusion rate of the conjugates inside the leukemia cells. This potent and selective antitumor activity of the oligopeptide-acridine conjugates will guide future research in another direction. Futureresearch will be focused on the elucidation of the structure-activity relationships of the conjugate analogues and the investigation of the underlying mechanisms responsible for the antitumor activity. Het domein van de geneesmiddelenontwikkeling heeft de laatste 10 jaar een enorme evolutie gekend. Niet alleen de manier waarop potentiële geneesmiddelen getest worden is drastisch gewijzigd maar ook de informatie aangaande de onderliggende controlemechanismen van biologische processen is sterk toegenomen. Deze informatie moet ons in de toekomst in staat stellen om aandoeningen op een oorzakelijke wijze en in een vroeg stadium te behandelen. Het DNA, de drager van het genetische materiaal, blijkt hiervoor een geschikte receptor te zijn met ongelimiteerde mogelijkheden. Geneesmiddelen die in staat zijn om op een selectieve manier DNA te binden kunnen gebruikt worden voor de behandeling van kanker, genetische afwijkingen en infectiezieketen. Met dit doel voor ogen werden peptiden ontwikkeld die in staat zijn DNA te binden. Tevens werd ook een interessante selectieve antitumorale activiteit vastgesteld. Aldus kunnen deze peptiden beschouwd worden als ‘lead compounds’ in verder onderzoek naar nieuwe antitumorale behandelingsmethoden. During the last decade, the field of drug discovery and drug development has evolved dramatically. Not only the way potential drugs are screened these days has changed, but also the insights into the underlying mechanisms of life processes have grown dramatically. This information will allow us in the future to design drugs capable of stopping diseases in an early stage of development. DNA, the carrier of the genetic information, is therefore an attractive receptor with unlimited possibilities.Drugs that may be able to manipulate transcription of individual genes are potentially useful for the treatment of cancers as well as genetic and infectious diseases. With this goal, we designed small oligopeptides which are able to bind DNA. At the same time an interesting selective antitumor activity was observed. For this reason, these oligopeptides can be considered as lead compounds for the design of new antitumor agents.