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Like in other tissues, heart glycolysis is regulated by substrates supply, energy demand and hormones such as insulin. The stimulation of heart glycolysis by insulin implies the activation of 6-phosphofructo-2-kinase (PFK-2), the enzyme responsible for the synthesis of fructose-2,6-bisphosphate. This compound is a potent allosteric activator of 6-phosphofructo-1-kinase, a key glycolytic enzyme. Previous work from the laboratory has demonstrated that a lipid-kinase, the phosphoinositol-3 kinase (PI3-kinase), is involved in the activation of heart PFK-2 by insulin. PI3-kinase is known to activate different protein-kinases such protein-kinase B and p70 ribosomal protein S6 kinase (p70S6K). However, these different protein-kinases are not implicated in the activation of heart PFK-2 by insulin, as demonstrated recently in the laboratory. Therefore, another insulin-sensitive protein-kinases was partially purified. This protein-kinase is able to phosphorylate and activate heart PFK-2 “in vitro” and has been called WISK for wortmannin-sensitive and insulin stimulated protein-kinase.
The aim of this work was to improve the purification protocol of WISK to allow its identification. To reach these objectives, we have adapted the methodology to increase the yield by using hearts from different species. In addition, we have introduced new purification steps. The use of rabbit hearts treated by insulin and chromatographic purification on protamine-agarose and phenyl-superose led to the purification of two different protein-kinases, originally present in WISK. The first, slightly insulino-sensitive, is related to the family of p-21 activated protein-kinase. The second, strongly insulino-sensitive, is not yet identified, but is probably a protein-kinase associated to heat shock protein. Both are able to phosphorylate and activate heart PFK-2 in vitro. La glycolyse du cœur, comme celle d’autres tissus, est soumise à un contrôle par l’apport de substrats, la demande énergétique et par des hormones telles que l’insuline. La stimulation de la glycolyse cardiaque par l’insuline implique l’activation de la 6-phosphofructo-2-kinase (PFK-2), l’enzyme responsable de la synthèse de fructose-2,6-bisphosphate. Ce composé est un activateur allostérique puissant de la 6-phosphofructo-1-kinase, une enzyme clef de la glycolyse. Les travaux antérieurs du laboratoire d’accueil ont mis en évidence l’implication d’une lipide-kinase, la phosphoinositol-3-kinase (PI3-kinase), dans l’activation de la PFK-2 cardiaque par l’insuline. La PI3-kinase permet l’activation de différentes protéine-kinases, telles que la protéine-kinase B (PKB) et la protéine-kinase de 70 kDa phosphorylant la sous-unité S6 du ribosome (p70S6K). Cependant, ces différentes protéine-kinases ne sont pas nécessaires à l’activation de la PFK-2 cardiaque par l’insuline, ainsi que l’ont montré les travaux récents du laboratoire. Par conséquent, une autre protéine-kinase insulino-sensible a été recherchée et partiellement purifiée. Cette protéine-kinase est capable de phosphoryler et d’activer la PFK-2 cardiaque « in vitro », elle est appelée WISK (wortmannin-sensitive and insulin stimulated protein-kinase).
Le travail expérimental présenté dans ce mémoire visait à améliorer le protocole de purification de WISK en vue de son identification. Pour atteindre ces objectifs, nous avons dû adapter la méthode afin d’obtenir suffisamment de matériel, et nous avons utilisé et comparé des cœurs provenant d’espèces différentes. Nous avons, de plus, introduit de nouvelles étapes de purification. L’utilisation de cœurs de lapin traités à l’insuline et de chromatographies sur protamine-agarose et phényl-superose ont abouti à la purification de deux « PFK-2 kinases », qui étaient présentes dans la préparation originale de WISK. La première, légèrement insulino-sensible, fait partie de la famille des p21-activated kinases (PAK). La seconde, fortement insulino-sensible, doit encore être identifiée, mais est probablement une protéine-kinase associée aux protéines de choc thermique (HSP). Toutes deux sont capables de phosphoryler et d’activer la PFK-2 cardiaque in vitro

Glycolysis --- Heart --- Insulin