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IN SITU HYBRIDIZATION --- LABORATORY MANUALS --- NUCLEOTIDE SEQUENCE --- METHODS --- IDENTIFICATION

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Le col de l’utérus est tapissé par deux muqueuses : l’endocol et l’exocol. C’est au niveau de la jonction squamo-cylindrique qu’on observe le plus souvent des transformations malignes. On distingue différentes lésions du col utérin : les lésions condylomateuse, les lésions précancéreuses (dysplasies) et les cancers du col. On classe les dysplasies en légères (CIN 1), modérées (CIN 2) et sévères (CIN 3). Parmi les cancers du col, on rencontre des carcinomes in situ, des carcinomes micro-invasifs, des carcinomes invasifs ainsi que quelques rares cas d’adénocarcinomes.
La récente propagation du sida a attiré l’attention des scientifiques sur les maladies sexuellement transmissibles et par conséquent, sur les papillomavirus. Dans le cas des lésions cancéreuses du col de l’utérus, la présence importante d’HPV 16 et 18 a été mise en évidence par Zur Hausen et son équipe. Ces types d’ HPV peuvent également se retrouver dans les lésions précancéreuses du col utérin.
La détection des HPV 16 et 18 peut être effectuée par l’utilisation de l’hybridation in situ. Elle se base sur la formation d’un hybride entre la cible et la sonde marquée in vitro.
Cette technique d’hybridation in situ est influencée par plusieurs facteurs : la fixation (fixateur et temps de fixation), l’agressivité des traitements, le type de sonde, la température de fusion Tm, la stringence de l’hybridation et des post hybridation et le temps d’hybridation.
Elle se heurte à quelques difficultés : le décollement de coupes, le bruit de fond, l’obtention de cas « faux positifs » et « faux négatifs » et le prix de revient.
Ce travail tente d’optimaliser la technique d’hybridation in situ afin de permettre sa mise en routine dans des conditions pécuniairement acceptables.
Les différentes étapes de la technique sont : la fixation des tissus (formol), l’enrobage des prélèvements, la réalisation de coupes, l’étalement des coupes, la post fixation des coupes étalées, les déparaffinage, la digestion tissulaire, la préhybridation, la dénaturation proprement dite et la détection des HPV 16 et 18.
Lors de la réalisation de cette technique, nous avons été confrontés à quatre problèmes majeurs : les plis dans les coupes, le décollement des coupes, le calibrage de la plaque chauffante et le bruit de fond ;
Les plis provenant de l’étalement ont été réduits grâce à l’utilisation de deux températures croissantes.
Le décollement des coupes a été partiellement résolu par le choix judicieux de la dimension de ces coupes et par un recouvrement approprié des lames .
Le bruit de fond observé n’a pas pu être éliminé bien que différentes variations aient été testées : le recours à la RNase et la DNase, le temps de fixation, la stringence des lavages de post hybridation, l’usage d’un sonde oligonucléotidique. Remarquons que la mise au point de cette sonde n’a pas pu être menée à bien par manque de temps. Elle était cependant originale car, pouvant détecter simultanément les HPV 16 et 18, elle couvrait 70 % des lésions cancéreuses.
Différents faits (durée de la technique, prix de revient, matériel déjà fixé, faible sensibilité) semblent limiter l’intérêt clinique de la technique d’hybridation in situ. Cependant, c’est la seule technique qui permet une confrontation morphologique avec la détection virale.

Uterine Cervical Diseases --- Papillomaviridae --- In situ Hybridization --- Medical Laboratory Science

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Pathological biochemistry --- Molecular biology --- In situ hybridization --- Papillomavirus infections --- Polymerase chain reaction --- HIV infections --- Cytodiagnosis --- HIV Infections --- Polymerase Chain Reaction --- Tumor Virus Infections --- Papillomaviridae --- Hybridization, Genetic --- diagnosis --- Hybridization. --- Papillomavirus infections - Cytodiagnosis --- HIV infections - Cytodiagnosis --- HIV Infections - diagnosis --- Tumor Virus Infections - diagnosis