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Le sujet a traité du manque de rentabilité des analyses d'immunophénotypage réalisées en cytométrie en flux au laboratoire d'hématologie du CHU Saint Pierre. L'objectif de ce mémoire est d'une part, de réaliser la description de la situation actuelle de la cytométrie via une analyse partielle des processus et des coûts engendrés par cette activité. Et d'autre part, de proposer des pistes d'amélioration de la gestion technique de la cytométrie. Pour atteindre cet objectif, une analyse de coûts partielle a été menée aux laboratoires d'hématologie du CHU Saint Pierre et l'hôpital Erasme. Dans un deuxième temps, ce mémoire a comparé les deux processus d'analyses d'immunophénotypage suivies dans les deux laboratoires hospitaliers visités. Ces démarches ont eu comme objectif, l'ambition d'améliorer l'efficience de l'activité de la cytométrie en flux du CHU Saint-Pierre. Méthodes : Les coûts des réactifs des 7 types d'analyses d'immunophénotypage, usuellement effectuées au laboratoire pour des patients ambulatoires en diagnostic, ont été décortiqués en coûts par test, par préparation de cocktail et par valorisation. Ces données furent comparées avec celle obtenues au laboratoire d'hématologie de l'hôpital Erasme. Les deux processus étudiés ont été décrits et sectionnés en 8 étapes. Les différences de pratiques y ont été situées. Résultats : Au CHU Saint Pierre, les résultats ont démontrés une variation de coûts entre les analyses effectuées en cytomètre SC et en cytomètre !OC. Les coûts par test d'imrnunophénotypage sont inférieurs à l'hôpital Erasme par rapport au CHU Saint Pierre. De plus, il existe des différences de pratiques de cytométrie en flux entre les deux laboratoires. Ce mémoire a permis l'élaboration de 5 pistes d'amélioration applicables au secteur de cytométrie du CHU Saint Pierre.

Flow Cytometry --- Hematology --- Neoplasms --- Immunophenotyping

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The aim of this research is to study the immunophenotype of secreting lymphomas cells and especially of the Waldenstrom‘s Macroglobulinemia.
The secreting lymphomas, WM and lymphoplasmocytic lymphoma, are chronic B-cell lymphoproliferative disorders producing and secreting an IgM or IgG respectively
To characterize their immunophenotype, we compared WM cells with those of LPL to establish if there are specific surface markers between these two pathologies.
Then, we compared the immunophenotype if WM and LPL cells with this of normal B lymphocytes to evaluate which surface markers could be tested as sign of phenotypic disorder.
finally, to ameliorate the immunological differential diagnosis between secreting lymphomas and other chronic B-cell hemolymphopathies, the immunophenotype of WM and LPL cells has been compared with this of cells of other chronic B-cell lymphoproliferative syndromes, especially the chronic lymphocytic leukemia.
Because the samples were small and supposed to be “non-gaussien”, the Mann-Whitney test was chosen for comparison.
for the four comparisons realized, the statistics gave us different cell markers statistically significant at the 5% threshold. The markers were then evaluated for cytometric significance (difference > 5% or ≥ 50 CMF) and clinical significance (thresholds for abnormality).
The cell markers clinically significant are : - Comparison WM versus LPL : FMC7% and FMC7 IF
- Comparison WM et LPL versus normal B cells: CD25 % only with LPL, CD40 IF, CD54 IF, CD62L %, CD80 %, FMC7% only with WM, and IgD IF.
- Comparison WM and LPL versus LLC : CD5 % and IF, CD11a% and IF, CD18% and IF, CD20 % CD22% and IF, CD23 % and IF, CD25 %, CD38 %, CD43 %, CD54 IF, CD62L %, CD79a IF, CD79b IF, CD80 %, FMC7 % and IF, Ig κ/λ IF.
- Comparison WM and LPL versus other SPLC: CD54 IF, CD79b IF, CD80 %, FMC7 IF only with LPL, and Ig κ/λ IF.
In conclusion, only one marker is differently expressed on WM and LPL B cells. Some surface markers characterizing secreting lymphomas could be helpful for the differential diagnosis between lymphomas and other chronic lymphoproliferative syndromes Cette étude a pour but d’étudier l’immunophénotype des cellules des lymphomes sécrétants et en particulier de la Macroglobulinémie de Waldenström.
Les lymphomes sécrétants, WM et lymphome lymphoplasmocytaire, sont des hémolymphopathies malignes B produisant et sécrétant une IgM ou une IgG respectivement.
Pour caractériser les immunophénotype, nous avons comparé les cellules de WM avec les cellules de LPL de manière à déterminer s’il existe des marqueurs de surface spécifiques entre ces deux pathologies.
Ensuite, nous avons comparé l’immunophénotype des cellules de WM et LPL avec celui des lymphocytes B normaux afin d’évaluer quels marqueurs de surface peuvent être interprétés comme singes d’une anomalie phénotypique.
Enfin, pour faciliter le diagnostic différentiel entre les lymphomes sécrétants et les autres hémolymphopathies chroniques B, l’immunophénotype des cellules de WM et LPL a été comparé à celui des cellules des autres syndromes lymphoprolifératifs chroniques B et en particulier avec les cellules des leucémies lymphoïdes chroniques.
Ayant des petits échantillons dont au moins un des deux est non gaussien, la statistique utilisée pour réaliser les comparaisons est le test de Mann-Whitney.
pour chacune des quatre comparaisons faites, la statistique nous a fourni différents marqueurs de surface statistiquement significatifs au seuil α de 5%. Tous ces marqueurs ont alors été évalués pour définir quels sont ceux qui ont une signification cytométrique (différence > 5% ou ≥ 50 canaux médians d’intensité de fluorescence) et une signification clinique (par rapport à des valeurs de référence déterminant des critères d’anomalies phénotypiques).
Les marqueurs cliniquement significatifs sont :
- Comparaison WM versus LPL : FMC7% et FMC7 IF
- Comparaison WM et LPL versus cellules B normales : CD25 % uniquement avec LPL, CD40 IF, CD54 IF, CD62L %, CD80 %, FMC7% uniquement avec WM, et IgD IF.
- Comparaison WM et LPL versus LLC : CD5 % et IF, CD11a% et IF, CD18% et IF, CD20 % CD22% et IF, CD23 % et IF, CD25 %, CD38 %, CD43 %, CD54 IF, CD62L %, CD79a IF, CD79b IF, CD80 %, FMC7 % et IF, Ig κ/λ IF.
- Comparaison WM et LPL versus autres SPLC : CD54 IF, CD79b IF, CD80 %, FMC7 IF uniquement avec LPL, et Ig κ/λ IF.
Ceci nous permet de conclure qu’entre la WM et le LPL, seul le marqueur FMC7 montre une expression significativement différente. Certains marqueurs de membrane caractérisant les lymphomes sécrétants leur confèrent des anomalies phénotypes et peuvent ainsi améliorer le diagnostic différentiel entre les lymphomes sécrétants et les autres syndromes lymphoprolifératifs chroniques B

Flow Cytometry --- Lymphoma, B-Cell --- Waldenström Macroglobulimenia

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Flow cytometry is a sensitive and quantitative platform for the measurement of particle fluorescence. In flow cytometry, the particles in a sample flow in single file through a focused laser beam at rates of hundreds to thousands of particles per second. During the time each particle is in the laser beam, on the order of ten microseconds, one or more fluorescent dyes associated with that particle are excited. The fluorescence emitted from each particle is collected through a microscope objective, spectrally filtered, and detected with photomultiplier tubes. 

Flow cytometry is uniquely capable of the precise and quantitative molecular analysis of genomic sequence information, interactions between purified biomolecules and cellular function. Combined with automated sample handling for increased sample throughput, these features make flow cytometry a versatile platform with applications at many stages of drug discovery. Traditionally, the particles studied are cells, especially blood cells; flow cytometry is used extensively in immunology. 

This volume shows how flow cytometry is integrated into modern biotechnology, dealing with issues of throughput, content, sensitivity, and high throughput informatics with applications in genomics, proteomics and protein-protein interactions, drug discovery, vaccine development, plant and reproductive biology, pharmacology and toxicology, cell-cell interactions and protein engineering.


Biotechnology --- Biotechnology. --- Flow Cytometry --- Flow cytometry. --- methods. --- kwantitatieve analyse (chemie) --- Toxicology --- biotechnologie --- toxicologie --- flowcytometrie --- Flow cytometry --- methods --- farmacologie --- genomics --- moleculaire biologie --- proteomics --- vaccinatie --- Methods. --- Flow Cytometry - methods --- Biotechnology - methods

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In clinical practice, the ability to identify the presence of an abnormality on a blood smear is an important reliability determinant of a differential counting method. The clinical impact of a wrong differential count can be significant, which necessitates the presence of highly trained personnel for the microscopic review of the blood smears. However, interobserver and intraobserver variations in microscopy lead to difficulties in maintaining consistency in interpretation when rare events occur (generally less or equal to 2 % variation in the differential counts). Previously, studies employing automated image analysis systems dedicated to preclassifying the various types of WBC in peripheral blood smears, were performed in comparison with optical microscopy. In this work, we compare the results of final results obtained after morphological reclassification of cells by an expert technician in morphology using a digitizing microscope, the HemaCAM® system (n= 200 cells evaluated) with those obtained by optical microscopy (n=400 cells counted by two independant technologists) but also with those obtained by flow cytometry (FCM), considered as the reference method (“gold standard”), for blasts and lymphomatous ceils. In our comparison, we focused on 41 patients suffering from haematological neoplasias. We assessed the capability of the HemaCAM®, operating by a technician to classify accurately leukocytes and to detect abnormal circulating ceils (blast ceils, lymphomatous cells, immature myeloid ceils, plasma cells and NRBC). Blast cells and lymphomatous ceils were compared using the four methods (presence of flags on haematological analyzer, optical microscopy, HemaCAM® and flow cytometry). Increased sensibility and specificity to detect ail of these ceils, behalve NRBC, were demonstrated using HemaCAM in comparison with optical microscopy. The FCM permits to identify misclassification of blasts, lymphomatous ceils and atypical lymphocytes in acute leukemias and lymphomas. In combination with the HemaCAM system, the FCM allows morphological learning on objective bases. Increased accuracy of the differential count and recognition of qualitative abnormalities are the two major advantages of the HemaCAM system. Time sparing, conservation of cell images for each patient, education are the three other advantages of the HemaCAM system

Blood Cells --- Hematopoietic System --- Lymphoid Tissue --- Microscopy --- Flow Cytometry

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Présentation de l'éditeur : "Les instruments jouent un rôle primordial dans l'avancée scientifique et technologique. Les ouvrages de cette mini-série consacrée à l'optique dans les instruments ont pour but de montrer que l'optique et les composants optiques constituent souvent la partie essentielle autour de laquelle interviennent l'électronique, la mécanique et l'informatique. Le premier tome a décrit les bases nécessaires à la compréhension des phénomènes physiques mis en jeu. Ce second tome a pour but d'illustrer par divers exemples le rôle fondamental de l'optique dans l'instrumentation destinée à la biologie et à la médecine. Sont développés quelques instruments utilisés en routine pour l'analyse et la caractérisation, des instruments de très haute complexité permettant aux chercheurs d'avoir accès à des mesures ultra précises ainsi que des technologies prometteuses actuellement en développement. Enfin ces exemples permettront de voir l'impact des lasers non seulement dans l'instrumentation mais aussi dans les soins médicaux depuis l'ophtalmologie jusqu'à la chirurgie et le traitement de nombreuses maladies."

Optical Devices --- Microscopy, Confocal --- Microscopy --- Flow Cytometry --- Tomography, Optical Coherence --- Laser Therapy