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The telomeres are protected by a looped structure which is mediated by a protein complex called shelterin. In actively dividing cells, replication of telomeres requires the establishment of specialized compensatory systems to prevent their shortening. In the absence of compensation, telomeres shorten with each cell division until reaching the Hayflick limit, which is characterized by an arrest of cell division and entry into replicative senescence. In the early stages of embryonic development and in stem or germ cells, telomerase helps maintaining telomere length by synthesizing TTAGGG repeats through its reverse transcriptase activity. In other normal cells, telomerase expression is repressed. Unlike the vast majority of normal cells, cancer cells are characterized by unlimited proliferation and the reactivation of a telomere maintenance mechanism during the process of tumorigenesis. While reactivation of telomerase is the mechanism mostly found, 10-15 % of tumors implement an alternative lengthening of telomeres. These cells, called ALT , rely on homologous recombination events to lengthen shortened telomeres. The ALT phenotype is characterized by a great heterogeneity of telomere length due to the presence of extra-chromosomal telomeric DNA, specialized PML bodies called "ALT­ associated PML bodies" and telomeric variant sequences which bind orphan nuclear receptors. The establishment of ALT probably depends on the specific loss of homologous recombination inhibitors at the telomere, since this latter mechanism is suppressed in normal and cancer cells using telomerase. Recently, several studies have correlated the ALT phenotype with the Joss of expression of a histone chaperone called ATRX. ATRX is therefore a first candidate repressor of ALT. However, experimental inactivation by RNA silencing of this protein is not sufficient to activate ALT.The objective of this mémoire was to gain a better understanding of the molecular mechanisms of activation of ALT using comparative analyzes of cell lines using either ALT or telomerase. To this end, new cell lines of similar genetic background were generated through the technique of cell hybrids. The work in Master 1 has allowed us to identify two hybrids that appeared to have the ALT phenotype. Further analyzes were performed during Master 2 using in quantitative and qualitative techniques such as FISH, Western blot and activity measurement telomerase, to highlight the activation of ALT. These hybrids provide a basis for the identification of causative mutations.In addition to hybrids, we also initiated the study of tumors which display a high indience of ALT, such as sarcoma. The cell cultures were provided by a collaboration with the clinicat hospital of St-Luc. The analysis of these primary cultures should provide valuable information on the changes resulting in activation of ALT in vivo. Une structure en boucle. médiée par un complexe protéique appelé shelterin, permet la protection des extrémités chromosomiques, les télomères. Dans les cellules en division, la réplication des télomères requiert la mise en place de systèmes compensatoires spécialisés pour éviter leur raccourcissement. En l'absence de compensation, les télomères se raccourcissent à chaque division cellulaire jusqu'à atteindre la limite de Hayflick, caractérisée par un arrêt de division cellulaire et l'entrée en sénéscence réplicative. Lors des premiers stades du développement embryonnaire et dans les cellules souches ou germinales, la télomérase permet le maintien de la longueur des télomères en synthétisant les répétitions TTAGGG grâce à son activité de transcriptase inverse. Dans les autres cellules normales, l'expression de la télomérase est réprimée. A l'inverse de la grande majorité des cellules normales, les cellules cancéreuses se distinguent par une prolifération illimitée qu'elles doivent à la réactivation d'un mode de maintien des télomères au cours du processus de tumorigenèse. Deux mécanismes distincts de maintien des télomères ont été découverts dans les tumeurs. Alors que la réactivation de la télomérase est le mécanisme majoritairemen t retrouvé, 10-15% des tumeurs mettent en place un mécanisme alternatif d'allongement des télomères. Ces cellules, dites ALT, font appel à des phénomènes de recombinaison homologue pour allonger les télomères raccourcis.Le phénotype ALT se caractérise par une grande hétérogénéité de longueur des télomères, par la présence d'ADN télomérique extra-chromosomique, de corps PML spécialisés appelés « ALT-associated PML bodies » et de variants de séquences télomériques sur lesquels se fixent des récepteurs nucléaires dont la fonction aux télomères est toujours inconnue. La mise en place du mécanisme ALT dépend probablement de la perte spécifique d'inhibiteurs de recombinaison homologue au niveau du télomère puisque cette dernière est réprimée dans les cellules normales et dans les cellules cancéreuses faisant appel à la télomérase. Récemment, plusieurs études ont corrélé le phénotype ALT avec la perte d'expression d'une chaperone d'histone appelée ATRX. ATRX représente dès lors un premier candidat répresseur de ALT. Toutefois, l'inactivation expérimentale de l'expresssion d'ATRX par RNA silencing n'est pas suffisante pour activer ALT. L'objectif de ce mémoire était d'acquérir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de l'activation de ALT à l'aide d'analyses comparatives de lignées cellulaires faisant appel soit à ALT soit à la télomérase . A cette fin, de nouvelles lignées cellulaires de background génétique semblable ont été générées grâce à la technique des hybrides cellulaires. Le travail effectué en Master l nous a permis de déceler 3 hybrides qui semblaient présenter le phénotype ALT. De plus amples analyses ont été effectuées au cours du travail de Master 2 à l'aide de techniques permettant de mettre en évidence les différents phénotypes de ALT de manière quantitative et qualitative telles que le FISH, le Western Blot et la mesure d'activité de la télomérase. Ces hybrides serviront de base à l'identification future de mutations causatives. En plus des hybrides, nous avons également initié l'étude de tumeurs présentant fréquemment le phénotype ALT, telles que celles provenant de sarcomes, et qui nous sont fournies par une collaboration avec les cliniques St-Luc. L'analyse de ces cultures primaires devrait apporter des informations précieuses sur les mutations à l'origine de l'activation de ALT in vivo.

Hybrid Cells --- Neoplasms --- Phenotype --- Telomere Homeostasis --- Telomere Shortening

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Telomeres are structures made of DNA and proteins which protect chromosome ends. The hTERT catalytic subunit of telomerase, the enzyme that maintains telomeres, is not expressed in somatic cells. Therefore, forced divisions of normal cells induces progressive telomere shortening, resulting in p53 activation and cell cycle arrest called replicative senescence or Ml. When grown in culture, some cells do not reach Ml but are characterized by an MO premature senescence arrest that is probably a consequence of pI6/CDKN2A activation. ln addition, during tumorigenesis, cells with an activated oncogene, like Ras, also display premature senescence. Our laboratory is studying the impact of cellular senescence on DNA methylation level in human cells. Indeed, it has been proposed that cellular senescence may be one of the first steps of tumorigenesis, a process associated with a global decrease in DNA methylation. Previous results in the lab had shown a transient decrease in DNA methylation level of fibroblasts entering Ml replicative senescence in culture. We reproduced this experiment in normal melanocytes. We evaluated global DNA methylation level by a quantitative PCR approach measuring pericentromeric DNA Sat2 methylation and by measuring expression level of MAGE genes, normally repressed by promoter methylation. Our results suggest that DNA demethylation may occur during Ml senescence. On the other hand, we observed a premature entry into MO senescence of a subset of melanocytes. Some cells emerged from MO and started to proliferate again through apparent activation of telomerase. Their genome was not demethylated. We further observed Sat2 DNA demethylation in fibroblasts subjected to RasVl2 oncogene-induced senescence. We could not test the impact of RasVl2 in melanocytes that turned out to be highly sensitive to transductions. To circumvent this problem, we analysed MAGE, hTERT and p2I expression in cDNA samples collected from nevi and melanoma as nevi were proposed to correspond to pre-tumoral senescent stage of melanoma. Our results suggest the existence of an anti-correlation between the expression of hTERT on one hand and ofp2I/MAGE on the other hand. Together, our results led us to propose a model in which wc postulate that two distinct immortalization pathways may lead to melanoma formation: MO senescence bypass associated with the apparently « easy » activation of telomerase without DNA demethylation process or the passage through an Ml senescence step that might be associated with DNA demethylation. We also initiated the study of DNA methylation ID mammary epithelial cells. Preliminary results are shown. Les télomères sont composés d’ADN et de protéines protégeant les extrémités chromosomiques. La sous-unité catalytique hTERT de la télomérase, l’enzyme de maintien des télomères, n’est pas exprimée dans les cellules somatiques. Une division forcée de ces cellules entraîne donc un raccourcissement de l’ADN télomérique au fil des divisions cellulaires, aboutissant à l’activation de p53 et l’arrêt de prolifération cellulaire appelé sénescence réplicative ou Ml. Certaines cellules en culture présentent une sénescence prématurée MO avant même d’avoir atteint Ml. Celle-ci dépendrait sans doute de l’activation de p] 6/CDKN2A. En outre, lors de la tumorigenèse, les cellules ayant activé un oncogène, tel que Ras, présentent également une sénescence prématurée. Le laboratoire s’ intéresse à l’impact de la sénescence cellulaire sur le niveau de méthylation de l’ADN de cellules humaines En effet, on pense que la sénescence pourrait être une des premières étapes de la tumorigenèse, un processus caractérisé par une déméthylation globale du génome. Des premiers résultats du laboratoire avaient mis en évidence une baisse transitoire du niveau de méthylation de l’ADN dans des fibroblastes lors de l’entrée en sénescence réplicative Ml. Nous avons reproduit cette étude dans des mélanocytes normaux. Nous avons évalué l’état global de méthylation grâce à une PCR permettant de quantifier la méthylation de l’ADN du locus Sat2 péricentromérique et à la mesure de l’expression des gènes de la famille MAGE, normalement réprimés par méthylation de leur promoteur. Nos résultats suggèrent qu’une déméthylation de l’ADN pourrait avoir lieu en sénescence Ml. D’autre part, nous avons observé une sénescence prémature MO de certains mélanocytes. Des cellules ont émergé de cet état MO et recommencé à proliférer en ayant apparemment activé la télomérase. Leur génome ne présentait pas de déméthylation de l’ADN. Nous avons également observé une baisse de la méthylation de l’ADN Sat2 de fibroblastes suite à la sénescence induite par l’oncogène RasV 12. Nous n’avons pas pu tester l’impact de RasVl2 dans les mélanocytes, hypersensibles à la transduction. Pour pallier ce problème, nous avons analysé l’expression des gènes MAGE, hTERT et p2] dans des échantillons d’ADNc obtenus à partir de naevi et de mélanomes, les naevi étant décrits comme correspondants au stade de sénescence pré-tumorale des mélanomes. Nos résultats suggèrent une anti-corrélation entre l’expression d’hTERT d’une part et de p2]/MAGE d’autre part. Ensemble, nos résultats nous ont permis de proposer un modèle qui postule que deux voies d’immortalisation distinctes pourraient mener à l’apparition de mélanomes : le bypass d’une sénescence MO, associée à l’activation apparemment «aisée» de la télomérase sans processus de déméthylation de l’ADN ou le passage par une phase de sénescence Ml qui serait associée à une déméthylation de l’ADN. Nous avons également initié l’étude de la méthylation de l’ADN de cellules épithéliales mammaires. Les résultats préliminaires sont présentés

telomere --- Telomerase --- Cell Aging --- Polymerase Chain Reaction --- DNA Methylation --- Melanocytes --- Humans