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AMP-Activated Protein Kinases --- Diabetes Mellitus, Type 2 --- Obesity

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Insulin is a hormone involved in glucose homeostasis and in the control of lipid metabolism. In 1981, frank and his co-workers found that the glycogen metabolism, in isolated hepatocytes, was more sensitive to insulin than the insulin receptor. They explained this phenomenon by the presence of “spare receptors”. It involved that a slight activation of the insulin signalling pathway was sufficient to obtain maximal metabolic responses. Similar experiments performed in other tissues indicated that spare receptors were not present everywhere. This first aim of my work was to determine if the spare receptor phenomenon exists in the heart. Moreover, several experiments realised in our laboratory showed a difference in sensitivity between protein kinase B and the metabolic effect of insulin. This questioned the participation of this enzyme in the metabolic effect of insulin.
To answer these two questions, we incubated rat cardiomyocytes with various concentration of insulin. Dose-responses curves were established, describing the effects of insulin on its signalling pathway and on metabolism. The targets studied in the signalling pathway were the insulin receptor, phosphatidylinositol-3 kinase, protein kinase B and glycogen synthase kinase-3. The metabolic responses studied here were glucose uptake and fructose-2;6-P2 concentration. The final step was to compare the ED50 obtained for each target studied. The ED50 represents the concentration of ligand that causes 50% of the maximal effect. A similar ED50 value (± 17 nM) was obtained for all elements of the insulin signalling pathway, from IR to GSK-3. By contrast, the two metabolic responses studied here were more sensitive (± 1.2 nM). From these results, we can conclude that spare receptors for insulin indeed exist in the heart and that a role of PKB in the metabolic effects of insulin can not be excluded L’insuline joue un rôle essentiel dans l’homéostasie du glucose et dans le contrôle du métabolisme des lipides. En 1981, Frank et collaborateurs ont mis en évidence, dans des hépatocytes en suspension, la présence d’une différence de sensibilité à l’insuline entre le récepteur insulinique et le métabolisme du glycogène, ce dernier étant le plus sensible. Ils avaient, à l’époque, expliqué ce phénomène par l’existence de « récepteurs de réserve » ou « spare receptors ». La présence de ces récepteurs de réserve impliquait qu’une petit activation au départ de la voie de signalisation de l’insuline était suffisante pour obtenir des réponses métaboliques maximales. Des expériences similaires ont ensuite été effectuées dans d’autres tissus et ont montré que la présence d’une telle différence de sensibilité à l’insuline varie en fonction du tissu étudié. Le premier objectif de mon travail a été par conséquent de savoir qu’est-ce qu’il en était du tissu cardiaque. D’autre part, des expériences réalisées dans notre laboratoire avaient mis en évidence l’existence d’une différence de sensibilité à l’insuline entre la protéine kinase B et les effets métaboliques de cette hormone, dans le cœur. Cela remettait en question la participation de cette enzyme aux effets métaboliques de l’insuline. Pur pouvoir répondre à ces deux questions, la première étape a été d’incuber des cardiomyocytes de rats aves des concentrations croissantes en insuline. Des courbes doses-réponses ont ensuite été établies, celles-ci décrivant les effets de l’insuline sur sa voie de signalisation et sur le métabolisme glucidique. Les cibles qui ont été étudiées dans la voie de signalisation sont le récepteur insulinique, la phosphatidylinositol 3-kinase, la protéine kinase B et la glycogène synthase kinase-3. D’autre part, les deux réponses métaboliques qui ont été choisies sont le captage du glucose et l’augmentation de la concentration en fructose-2,6-P2. Enfin, la dernière étape a été de déterminer et de comparer les ED50 obtenues pour chacune des courbes. La ED50 désigne la concentration en ligand nécessaire pour obtenir 50% de l’effet maximal. Les ED50 sont semblables pour tous les constituants de la voie de signalisation de l’insuline (± 17 nM). Les effets métaboliques, quant à eux, sont caractérisés par une sensibilité plus élevée envers l’insuline (± 1,2 nM). Ce travail montre donc que le phénomène de récepteurs de réserve est bien présent dans le cœur. De plus, nous ne pouvons pas exclure la participation de la PKB aux effets métaboliques de l’insuline, dans le cœur

Insulin --- src Homology Domains --- Mitogen-Activated Protein Kinases --- 1-Phosphatidylinositol 3-Kinases

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In this study, we tried to have a further understanding about how AMPK regulates 0- GlcNAcylation. Firstly, we studied the role of 0-GlcNAcylation in the anti-hypertrophic effect of AM PK at high concentration of AMPK activators, known to also regulate protein synthesis and gene transcription. In order to study if AMPK can also reverse hypertrophy in vitro and not only prevent it, we conducted some experiments where hypertrophy was already established before AMPK activation. Moreover, we confirmed the previous results of the laboratory in another in vivo mode!, namely TAC (Transverse Aortic Constriction) and we tried to define how AMPK regulates the three major enzymes of HBP by studying their transcriptional regulation and phosphorylation state. Finally, we started to elaborate an 0-GlcNAcylomic approach to identify the main targets of 0-GlcNAcylation and see which ones show an increase of 0-GlcNAcylation state during cardiac hypertrophy and a decrease following AMPK activation. Cardiac hypertrophy is defined by an increase in heart mass and is initially considered as an adaptive cellular response that tries to maintain cardiac output. However, under prolonged pathological stimuli, cardiac hypertrophy leads to impaired cardiac function and the development of heart failure. A potential target in the prevention of myocardial hypertrophy is the AMP-activated protein kinase (AMPK), a serine/threonine protein kinase acting as a sensor and regulator of cellular energy metabolism. Many studies have already shown that AMPK is a key inhibitor of pathological cardiac hypertrophy due to its ability to inhibit cardiac hypertrophy-related pathways such as protein synthesis (mTOR/P70S6K) and gene transcription (MAPK and NFAT/calcineurin). However, the underlying mechanism is challenged since the recent discoveries from CARD laboratory. Indeed, they showed that low dose of AMPK activator prevents cardiac hypertrophy without affecting the known AMPK targets involved in this pathology. Therefore, they proposed 0-GlcNAcylation, a post­ translational modification dependent on the hexosamines biosynthetic pathway (HBP) to be involved. Indeed, previous studies have shown that protein 0-GlcNAcylation levels are increased in cardiac hypertrophy. Interestingly, the laboratory showed that activation of AMPK is able to inhibit the increase of 0-GlcNAcylation caused by pro-hypertrophic agents such as phenylephrine (PE) in vitro and Angiotensin II (Angll) in vivo. Their hypothesis is that AMPK inhibits 0-GlcNAcylation by regulating the three main enzymes involved in this process, namely fructose-6-phosphate amidotransferase (GFAT), 0-GlcNAc transferase (OGT) and 0- GlcNAcase (OGA).

AMP-Activated Protein Kinases

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Diabetes Mellitus, Type 2 --- Insulin Resistance --- AMP-activated protein kinases

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Both insulin and amino acids lead to the activation of the mTOR/p70S6K pathway in the heart. The molecular mechanisms involved in the insulin pathway are well-known. By contrast, the pathway by which the amino acids induce the activation of mTOR/p70S6K need to be fully elucidated. In this study, we attempted to highlight variations in the regulation of cardiac p70S6K during the postnatal development. First, we studied the effects of two amino acids, leucine and glutamine, as well as insulin, on p70S6K activation in the heart of NMRI mice of 2, ¾ and 12 weeks of age. Hearts from overnight fasted mice were perfused by the Langendorff method. In parallel, similar experiments have been done in adult and newborn rat cardiomyocytes in primary culture. We showrd that insulin and leucine significantly increased p70S6K activation and phosphorylation in all ages and in both models. However, we noticed a difference in sensitivity towards insulin and leucine. Indeed, in the two weeks-old mice, leucine had a more important effect than insulin and this phenomenon is reversed at the adult stage. In parallel, we observed an opposite effect of glutamine on p70S6K regulation in the adult cardiomyocytes compared to those of newborn. Indeed, in the latter, glutamine induced p70S6K activation whereas, it became an inactivator of the same protein kinase at 12 weeks. PKB, which is responsible of the insulin-dependent activation of p70S6K, is clearly not involved in these amino acids effects. Indeed PKB seemed to be insensitive to leucine and glutamine in both models. Moreover, we tried to elucidate the molecular mechanisms implicated in the activation of p70S6K by leucine in adult hearts. We used rapamycin which is an mTOR inhibitor, and two PI3K inhibitors, wortmannin and LY294002. These experiments, together with recent results obtained in the lab, demonstrated that leucine activated cardiac p70S6K via a PI3K-like/PDK1/mTOR-dependent but PKB independent pathway. L'insuline, tout comme les acides aminés mène à l'activation de la voie mTOR/p70S6K cardiaque. Contrairement à la voie de signalisation impliquée dans les effets de l'insuline qui est quasi totalement identifiée, la voie empruntée par les acides aminés contient encore beaucoup d'inconnues. Dans cette étude, nous avons tout d'abord tenté de mettre en évidence des variations de la régulation de la p70S6K cardiaque au cours du développement post-natal. Pour ce faire, nous avons étudié les effets des deux acides aminés, la leucine et la glutamine, ainsi que de l'insuline dans l'activation de la p70S6K cardiaque de souris NMRI de 2, 3/4 et 12 semaines. Les cœurs ont été perfusés par la méthode dite de Langendorff. Des expériences similaires ont été également conduites dans des cardiomyocytes de rats adultes et nouveaux-nés en culture primaire. Nous avons démontré que l’insuline et la leucine induisent bien la phosphorylation et l'activation de la p70S6K à tous les âges et ceci dans les deux modèles. Nous avons de plus remarqué qu'il existait une différence de sensibilité envers l'insuline et la leucine. En effet, chez la souris de 2 semaines, la leucine aurait un effet plus important que l'insuline sur l'activation et la phosphorylation de la p70S6K cardiaque alors que ce phénomène s'inverse au stade adulte. En parallèle nous avons observé un effet opposé de la glutamine sur la régulation de la p70S6K dans les cardiomyocytes adultes par rapport à ceux de nouveaux-nés. En effet, chez ces derniers, elle induit clairement une activation alors qu'à 12 semaines, elle serait plutôt inhibitrice de la p70S6K. La PKB qui est responsable de l'activation insulino-dépendante de la p70S6K, ne peut expliquer toutes ces différences de sensibilité aux acides aminés. La PKB semble, en effet, tout à fait insensible à la leucine et à la glutamine, quel que soit le modèle. Dans un second temps, nous avons tenté d'élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans l'activation de la p70S6K cardiaque par la leucine chez l'adulte. L'utilisation de différents inhibiteurs en association aux travaux récents du laboratoire d'accueil, nous ont permis de démontrer que la leucine activait la p70S6K via une voie de signalisation dépendante d'une triade PI3K-like/PDK1/mTOR, indépendante de PKB et clairement différente de la voie de signalisation de l'insuline.

Ribosomal Protein S6 Kinases --- Leucine --- Protein Synthesis Inhibitors --- Heart --- Mice --- Myocytes, Cardiac