Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Theileria parva, een door teken overgedragen bloedparasiet van runderen in Zuid-, Centraal- en Oost-Afrika, veroorzaakt ‘East Coast fever’ (ECF) of Oostkustkoorts, een acute lymfoproliferatieve ziekte. Protectieve immuniteit wordt gemedieerd door CD8+ cytotoxische T lymfocyten gericht tegen schizont-geïnfecteerde cellen. Het polymorf immunodominant molecule (PIM) is een oppervlakte-eiwit van de schizont dat omwille van zijn polymorfisme mogelijk een rol speelt in de protectieve immuniteit tegen T. parva. Het primaire doel van dit werk was om via DNA-vaccinatie met PIM na te gaan of PIM inderdaad epitopen bevat die herkend worden door cytotoxische T lymfocyten (CTL). Door PIM te presenteren in afwezigheid van andere schizontantigenen worden de MHC-moleculen van de runderen gelimiteerd tot de selectie van PIM-epitopen. Daardoor kan enkel een PIM-specifieke CTL-respons geïnduceerd worden. Als PIM-specifieke CTL inderdaad opgewekt kunnen worden en deze ook parasiet-geïnfecteerde cellen kunnen afdoden, dan is daarmee voor het eerst bewezen dat PIM gepresenteerd wordt door schizontgeïnfecteerde cellen en dat PIM een kandidaat antigeen is voor het ontwikkelen van een subunit-vaccin tegen ECF. PIM-expressieconstructen werden aangemaakt en deze werden getest in vitro door transiënte transfectie van apenfibroblasten (COS-7). De sterkste expressie werd bekomen met een chimeer gen dat bestond uit de coderende sequentie van PIM gekoppeld aan het gen dat codeert voor ‘enhanced green fluorescent protein’ (EGFP), een groen fluorescerend modelproteïne. Aangezien PIM 3 voorspelde transmembraanhelices bevat werd verwacht dat EGFP-PIM zou aggregeren in het cytoplasma. Verrassend genoeg was dit niet het geval, en zowel PIM als EGFP-PIM bleken te associëren met het endoplasmatisch reticulum (ER) en met intracytoplasmatische vetdruppels. Om na te gaan welke regio van PIM verantwoordelijk is voor deze interactie werden de verschillende regio’s van PIM aan EGFP gekoppeld en tot expressie gebracht in COS-7 cellen. Daaruit bleek dat de C-terminale transmembraanhelices verantwoordelijk zijn voor de localizatie van PIM in de ER-membraan. Expressie van EGFP-NtPIM, een construct dat bestaat uit de hydrofiele aminoterminus en centrale regio van PIM, leidde tot een verspreide cytoplasmatische expressie, zonder enige klaarblijkelijke interactie met het cytoskelet of het ER van de gastheercel. Omwille van de sterkere expressie van EGFP-PIM in vergelijking met PIM alleen werd pcDNA4-egfp-pim gekozen voor DNA-immunizatie van runderen. Het vaccin werd intradermaal toegediend met de PigJet, een naaldlooze hogedrukinjector. De gevaccineerde dieren vertoonden EGFP- en PIM-specifieke antistoffen en een PIM- en parasietspecifieke T helper respons, wat aantoont dat EGFP-PIM in voldoende mate tot expressie gebracht werd om een immuunrespons te induceren. Veel belangrijker is echter dat parasiet-specifieke cytotoxische cellen geïnduceerd werden in beide gevaccineerde dieren en niet in het controledier. In kalf 1 waren de cytotoxische cellen MHC-I-gerestricteerd en werden dus klassieke CD8+ CTL geïnduceerd. Dit dier was ook beschermd tegen een dodelijke infectie met sporozoieten van T. parva. In kalf 2 was de cytotoxiciteit echter niet MHC-gerestricteerd en werden dus andere effectorcellen geïnduceerd. Kalf 2 was niet beschermd tegen de infectie en bleek zelfs vatbaarder te zijn dan het controledier. In vergelijking met kalf 1 had kalf 2 een sterkere Th-respons, wat zou kunnen wijzen op een verband tussen de sterkte of de aard van de Th-respons en de mogelijkheid om parasiet-specifieke CD8+ CTL op te wekken. Tenslotte, aangezien goede expressie van EGFP-NtPIM in COS-7 cellen bekomen werd, werd dit recombinant antigeen gebruikt om een nieuwe PIM-gebaseerde serodiagnostische test voor ECF te ontwikkelen. Hoewel een ELISA gebaseerd op een fusie van PIM met glutathion-S-transferase commerciëel beschikbaar is, wordt de meer arbeidsintensieve indirecte fluorescente antilichaamtest (IFAT) nog altijd gebruikt voor serodiagnose van T. parva-infecties. Daarom hebben we een nieuwe, specifiekere ELISA ontwikkeld op basis van EGFP-NtPIM. In deze studie tonen we aan dat sera van runderen die geïnfecteerd zijn met Fasciola hepatica kruisreactie kunnen veroorzaken op GST-PIM, maar niet op EGFP-NtPIM gecoate platen. Bij de verdere karakterisatie van de test werden echter wel nog vals positieve reacties waargenomen met sera van Trypanosoma-geïnfecteerde runderen. Deze sera reageerden positief in beide ELISA’s en in Western blot en herkenden ook schizonten in IFAT. De format van de test werd daarom veranderd naar een specifiekere competitie-ELISA, maar de Trypanosoma-antisera reageerden nog altijd positief. Bij serodiagnose van ECF moet dus altijd rekening gehouden worden met mogelijke valse positieve reacties in kudden met een hoge prevalentie voor infecties met Trypanosoma spp. East Coast fever (ECF), an acute lymphoproliferative disease of cattle in sub-Saharan Africa, is caused by the apicomplexan parasite Theileria parva. Protective immunity against the parasite is mediated by CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL) directed against schizont-infected cells. The polymorphic immunodominant molecule (PIM) is a ubiquitously expressedschizont surface protein that has been hypothesized to play a role in protective immune responses against T. parva, mostly based on the allelic diversity of its coding sequence. The primary objective of this work was to test whether PIM contains epitopes recognized by CTL by inducing a PIM-specific cellular immune response in cattle by DNA immunization. By presenting PIM in isolation from other T. parva-antigens, the epitope selection by the bovine MHC class I molecules is limited to PIM-derived epitopes, thereby forcing the generation of a PIM-specific CTL response. If PIM-specific CTL can be generated and if these are demonstrated to kill parasite-infected lymphocytes, this proves that PIM-derived epitopes are presented by schizont-infected cells and hence that PIM is a potential target for a subunit vaccine against ECF. PIM expression plasmids were constructed and tested by transient transfection of simian fibroblasts (COS-7). The best expression level was obtained using a chimeric gene consisting of the PIM coding sequence fused to the gene encoding enhanced green fluorescent protein (EGFP). Because PIM contains 3 predicted transmembrane helices, it was expected that EGFP-PIM would aggregate in the cytoplasm of transfected cells. Instead, both EGFP-PIM and PIM alone were shown to localize to the endoplasmic reticulum (ER) and to lipid droplets. By expressing different regions of PIM fused to EGFP, we have shown that the C-terminal region containing the transmembrane helices is necessary for the localization of PIM to the ER membrane. Expression of EGFP-NtPIM, a construct containing only the hydrophilic aminoterminal and central regions of PIM, resulted in a diffuse cytoplasmic distribution, without any apparent interaction with the host cell cytoskeleton. The DNA vaccine encoding EGFP-PIM was administered to cattle intradermally by jet-injection. The vaccinated animals showed both EGFP- and PIM-specific antibodies and PIM-specific and parasite-specific T helper responses, indicating that the fusion antigen was expressed in sufficient amounts for inducing an immune reaction. More importantly, parasite-specific cytotoxic cells could be generated from both vaccinated animals and not from a naive animal. In calf 1, the cytotoxic cells were MHC-I-restricted and therefore represent CD8+ CTL. This calf was protected from a lethal challenge. In contrast, the parasite-specific cytotoxicity in calf 2 did not appear to be MHC-restricted and that animal developed acute ECF upon challenge. Interestingly, calf 2 exhibited a much stronger T helper response than calf 1, which could indicate an association of the strength or the nature of the T helper resonse with the ability to develop parasite-specific CTL. Finally, because high protein levels of EGFP-NtPIM were obtained in COS-7 cells, we used this recombinant PIM for the development of a new PIM-based serodiagnostic enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for ECF. Although an antibody capture ELISA based on a fusion of PIM with glutathione S-transferase (GST) is commercially available, the more labor intensive indirect fluorescent antibody test (IFAT) still is the preferred method of choice for serodiagnosis of T. parva infections. Here we demonstrate cross-reaction of sera from Fasciola hepatica-infected cattle on GST-PIM but not on EGFP-NtPIM coated plates, showing that the EGFP-NtPIM antibody capture ELISA is more specific than the commercialtest. However, some sera from Trypanosoma-infected cattle reacted with EGFP-NtPIM and GST-PIM and were shown to recognize PIM in IFAT and Western blot. Changing the format of our assay to a capture competition ELISA did not solve the cross-reactivity of the Trypanosoma-antisera. Therefore, regardless of the serodiagnostic test that is used, care must be taken in the interpretation of test results in herds with a high prevalence of Trypanosoma spp. Dit werk handelt over Theileria parva, een bloedparasiet van runderen in Zuidelijk Afrika. Theileria wordt door teken overgedragen en is verwant met de parasiet die in mensen malaria veroorzaakt. T. parva veroorzaakt Oostkustkoorts of ‘East Coast fever’ (ECF), een erg acute aandoening met een hoge mortaliteit. Bijgevolg leidt ECF tot grote economische verliezen voor de kwestbare Afrikaanse veeteelt. Dieren kunnen beschermd worden tegen ECF door vaccinatie met de levende parasiet. De dieren die met een bepaalde stam gevaccineerd zijn vertonen echter in vele gevallen geen bescherming tegen een andere stam, waardoor cocktails van stammen moeten worden toegediend om de runderen voldoende te beschermen. Bovendien blijven gevaccineerde dieren vaak dragers van de geïnjecteerde parasieten en vormen die zo een bron van infectie voor de tekenpopulatie. Daarom is vaccinatie met de levende parasiet niet duurzaam en worden er momenteel alternatieven gezocht op basis van een onderdeel van de parasiet. Hier hebben we ons toegespitst op 1 bepaald antigeen, nl. het polymorf immunodominant molecule of PIM. Ons hoofddoel was om de immunogeniciteit van PIM te testen via DNA vaccinatie: in plaats van runderen rechtstreeks te vaccineren met PIM wordt het DNA dat codeert voor PIM toegediend, waardoor de dieren zelf het antigeen aanmaken. Uit een eerste in vitro studie bleek dat PIM beter tot expressie gebracht kan worden door het genetisch te koppelen aan het gen dat codeert voor GFP of groen fluorescerend proteïne. Dit is belangrijk, aangezien het expressieniveau van het antigeen een grote impact heeft op de immunogeniciteit van een DNA vaccin. Door de expressie van PIM in vitro te bestuderen kwamen we ook tot de vaststelling dat PIM associeert met de membranen van het endoplasmatisch reticulum in de cel. Deze op het eerste zicht spontane interactie was verrassend en kan belangrijke gevolgen hebben voor de biologie van PIM of aanverwante eiwitten. Vervolgens werden runderen gevaccineerd met het PIM DNA vaccin. De dieren vertoonden antistoffen tegen PIM, wat aantoont dat het proteïne in voldoende mate aangemaakt werd in de dieren om een immuunrespons te induceren. Belangrijker is dat we ook parasiet-specifieke cellulaire immuniteit konden aantonen, en dat die correleerde met bescherming tegen een dodelijke infectie. Daarmee werd voor het eerst bewezen dat PIM een rol kan spelen in de bescherming tegen T. parva. In een laatste deel hebben we ons PIM-construct ook gebruikt voor de verbetering van de bestaande serologische test voor diagnose van ECF. We toonden aan dat onze nieuwe test even gevoelig is als de bestaande test en bovendien specifieker is. Alleen antistoffen tegen Trypanosoma, een verwante parasiet die ook in de ECF-gebieden voorkomt, bleken nog steeds kruisreactie te kunnen veroorzaken.

Academic collection --- 577.27 --- 576.893.192.1 --- 619 --- Molecular bases of immunity. Molecular immunology --- Coccidia. Eimeria --- Diseases of domesticated animals. Veterinary science --- Theses --- 619 Diseases of domesticated animals. Veterinary science --- 576.893.192.1 Coccidia. Eimeria --- 577.27 Molecular bases of immunity. Molecular immunology --- 619 Ziektes van gedomesticeerde dieren. Diergeneeskunde --- Ziektes van gedomesticeerde dieren. Diergeneeskunde

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Proefschriften --- Thèses --- diergeneeskunde --- dierenziekten --- rundvee --- 636.2 --- 619 --- 616.2 --- Large ruminants. Cattle, oxen --- Diseases of domesticated animals. Veterinary science --- Pathology of the respiratory system. Complaints of the respiratory organs --- 616.2 Pathology of the respiratory system. Complaints of the respiratory organs --- 619 Diseases of domesticated animals. Veterinary science --- 636.2 Large ruminants. Cattle, oxen --- 619 Ziektes van gedomesticeerde dieren. Diergeneeskunde --- Ziektes van gedomesticeerde dieren. Diergeneeskunde --- Cattle diseases --- Respiratory tract diseases --- Economics --- Drug therapy --- Diagnosis

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Zoology and Animal Sciences. Veterinary Science --- Animal Pathology. --- 614.449 --- 636.4 --- 619 --- 619 Diseases of domesticated animals. Veterinary science --- Diseases of domesticated animals. Veterinary science --- 636.4 Pigs. Swine --- Pigs. Swine --- 614.449 Measures affecting animals. Destruction of vermin, parasites (rats, insects etc.). Rodent control. Protection of useful animals --- Measures affecting animals. Destruction of vermin, parasites (rats, insects etc.). Rodent control. Protection of useful animals --- Theses --- 619 Ziektes van gedomesticeerde dieren. Diergeneeskunde --- Ziektes van gedomesticeerde dieren. Diergeneeskunde

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

616.995.132 --- 595.132 --- 636.4 --- 614.449 --- 619 --- Nematode infestations. Threadworm. Trichuriasis. Filariasis. Ascaridiasis. Hookworm. Ankylostomiasis --- Nematodes. Roundworms. Threadworm. Eelworm. Vinegar eel. Gapeworm. Hookworm --- Pigs. Swine --- Measures affecting animals. Destruction of vermin, parasites (rats, insects etc.). Rodent control. Protection of useful animals --- Diseases of domesticated animals. Veterinary science --- Theses --- 619 Diseases of domesticated animals. Veterinary science --- 614.449 Measures affecting animals. Destruction of vermin, parasites (rats, insects etc.). Rodent control. Protection of useful animals --- 636.4 Pigs. Swine --- 595.132 Nematodes. Roundworms. Threadworm. Eelworm. Vinegar eel. Gapeworm. Hookworm --- 616.995.132 Nematode infestations. Threadworm. Trichuriasis. Filariasis. Ascaridiasis. Hookworm. Ankylostomiasis --- 619 Ziektes van gedomesticeerde dieren. Diergeneeskunde --- Ziektes van gedomesticeerde dieren. Diergeneeskunde