Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Tegenwoordig worden orale implantaten routinematig gebruikt voor rehabil itatie van het tandenloze kaakbot. In het anterieure kaakbot wordt deze procedure over het algemeen als ongecompliceerd geacht, zonder ver gaande risico’s op zenuwschade. In de huidige thesis werden chirurgische , radiografische en anatomische overwegingen geëvalueerd, om risico’s vo or neurosensorische storingen en bloedingen te kunnen inschatten (Hoofds tuk 6). Deze evaluatie toonde contradictorische rapporteringen inzake ne urovascularisatie en de publicatie van enkele case reports met neurovasc ulaire problemen na operaties in de anterieure kaak. Het was dan o ok duidelijk dat het anterieure kaakbot herbekeken moest worden door mid del van meer geraffineerde en gespecialiseerde beeldvormingtechnieken vo or het bestuderen van neurovascularisatie. In deze thesis werden hierbij in totaal 20 menselijke kadaverstukken, 535 droge onderkaken, 163 droge schedels en 676 klinische datasets gebruikt. De eerste reeks (n=20 kadavers, 380 droge onderkaak en 163 droge schedel s) werd gebruikt voor uiteenlopende macro- en micro-anatomische dissecti es met verdere micro-anatomisch onderzoek waarbij histologie in overeens temming werd gebracht met Hoog Resolutie Magnetische Resonantie beelden van het kaakbot (HR-MRI). Dit onderzoek toonde aan dat betande en tanden loze kaken een significante variatie vertonen in het voorkomen van het m andibulair kanaal, mandibulair incisief kanaal en linguaal kanaal alsook het maxillaire nasopalatale kanaal (Hoofdstukken 1, 2 en 3). Al deze ka naalstructuren bevatten een neurovasculaire bundel, waarvan de diameter groot genoeg kan zijn om klinisch significante trauma’s te veroorzaken. Een zorgvuldige preoperatieve radiografische analyse van de kaken is daa rom aangewezen. Deze resultaten lieten vervolgens ook toe om een radiogr afisch onderzoek uit te voeren naar de aanwezigheid, kenmerken en variab iliteit van structuren veroorzaakt door evolutionaire en raciale aspecte n (Hoofdstukken 4, 5, 7 en 8). Met de de wereldwijde mobiliteit heeft da t laatste vandaag zijn belang in de chirurgische benadering. Het gebruik van Cone Beam CT (CBCT) liet toe om alle anatomische kenmerken te bestu deren op grote hoeveelheden aan data. Tegelijkertijd werd geëvalueerd ho e accuraat deze CBCT beelden zijn bij de visualisatie van anatomische or iëntatiepunten en in de 3D modellering van het kaakbot en de gerelateerd e neurovasculaire kanalen/foramina (Hoofdstukken 9 en 10). De hoge accur aatheid van segmentatie en de goede diagnostische beeldkwaliteit (identi ficatie van oriëntatiepunten) biedt veelbelovende klinische perspectieve n, aangezien CBCT zich toont als een niet-invasieve techniek met een lag e kost en stralingsdosis, die bijzonder nuttig kan worden in de pre-oper atieve planningsfase. Als besluit, blijkt uit dit onderzoek dat er zich een uitgebreide neurov ascularisatie in de kaakbeenderen bevindt, met een significant klinisch impact wanneer deze structuren genegeerd worden. De grote variabil iteit van deze neurovasculaire structuren rechtvaardigt het gebruik van 3D beeldvorming voor visualisatie tijdens een pre-operatieve planningsfa se. Heden kan CBCT-beeldvorming naar voor geschoven worden als de gepref ereerde techniek om chirurgische complicaties te verminderen bij operati es aan het kaakbot, zoals het plaatsen van implantat

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Teeth play essential roles in food mastication, speech and psychological well-being. The human tooth consists of highly mineralized tissues of varying density and hardness, such as the enamel. This tissue is the most outer layer of the tooth crown, and is the hardest and highest mineralized tissue in the body. During tooth development, dental epithelial stem cells (DESCs) differentiate into ameloblasts that drive the enamel formation (amelogenesis). Once formed, human enamel cannot be repaired or renewed due to the apoptotic loss of the ameloblasts at the onset of tooth eruption. Restoration of damaged enamel tissue, as caused by trauma or bacterial disease, is currently accomplished using synthetic materials, however troubled by significant shortcomings. Therefore, the use of biologically derived enamel using human-derived DESCs is a highly searched solution. Hence, robust and reliable culture of human DESCs with the capacity to generate ameloblasts and the potential to produce mineralized tissue would be a major step forward in the dental regenerative field. Knowledge on human DESC phenotype and biological function is scarce. Intriguingly, indications for their existence have been found in the epithelial cell rests of Malassez (ERM), a network of cells present in the dental follicle (DF) which encloses unerupted teeth and remains present in the periodontal ligament (PDL) around the root upon tooth eruption. ERM cells co-cultured with dental pulp have been found to differentiate into ameloblast-like cells and generate enamel-like tissue. However, profound studies of the biology and specific role of ERM cells in enamel (re-)generation have been limited due to the lack of reliable study models. Current ERM in vitro culture systems are hampered by limited life span and quick loss of phenotype in the 2D conditions standardly used. Hence, a tractable in vitro system to faithfully expand, study and differentiate human DESCs is strongly needed. During the last decade, the powerful technique of organoid modeling has been on the rise to grow and explore tissue epithelial stem cells in vitro. This technology enables the epithelial stem cells to self-develop into 3D cell constructions when seeded into an extracellular matrix (ECM)-mimicking scaffold (typically, Matrigel) and cultured in a defined medium replicating the tissue's stem cell niche signaling and/or embryogenesis. Typical growth factors needed for organoid development and culture include epidermal growth factor (EGF) and wingless-type MMTV integration site (WNT) activators. The resultant organoids are characterized by high fidelity in mimicking the tissue epithelial (stem) cells of origin, as well as strong expandability while retaining their phenotype and functional properties, thereby overcoming the often-limited human tissue availability as acquired from the clinic. The powerful and versatile technology has led to the development of manifold organoid models from various human tissues. However, tooth-derived organoids, considered to be highly valuable for deep profiling of human tooth development, regeneration and disease, were not established yet. Here, we succeeded in developing a first-in-time tooth-derived organoid model starting from DF tissue of third molars (wisdom teeth) extracted from adolescent patients. Surprisingly, addition of the standardly added EGF did not activate but compromised organoid growth (in particular, their passageability). In the finally optimized medium (thus, without EGF), organoids could be obtained from DF tissue at 100% efficiency, which robustly expanded for more than 4-5 months. The organoids were found to display a tooth epithelial stemness phenotype similar to the DF's ERM. Single-cell transcriptomics reinforced this organoid-ERM congruence, while uncovering novel, mouse-mirroring stem cell features. Then, we analyzed whether this new organoid model could recapitulate reported (stem cell-related) functional properties of the ERM, more specifically the ability to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and to differentiate toward ameloblasts. Exposure of organoids to EGF induced transient proliferation followed by EMT and cell migration, thereby closely mimicking events taking place in the ERM in vivo, as for instance unfolding upon tooth insult. Subsequently, we investigated whether the organoids could unfold an ameloblast differentiation process in vitro using a specific differentiation medium. The organoids presented molecular changes constituting pathways that underlie ameloblast differentiation during amelogenesis. Moreover, single-cell RNA-sequencing interrogation advanced molecular transitions not revealed before in human amelogenesis. Also, bioinformatical (STRING) analysis projected protein-protein interactions that can further deepen our knowledge on amelogenesis in human tooth, at present only poorly understood. The organoids' ameloblast differentiation process was further enhanced by exposure to transforming growth factor-b (TGFb) and abrogated by TGFb receptor inhibition, thereby reproducing TGFb's known key position in amelogenesis. Interestingly, TGFβ was also found to promote PDL gene expression in the organoids, also reminiscent of ERM function in vivo. Next, we exposed the differentiated tooth organoids to an in vivo environment by transplanting them subcutaneously in immunodeficient mice, seeded into scaffolds. Interestingly, mineralized depositions were found in the organoid grafts as analyzed 4 weeks after transplantation. Although still preliminary, the presence of mineralization, electron-dense calcium-phosphate accumulations and intracytoplasmic deposits suggest that the organoids contribute to amelogenesis. Finally, we explored whether the presence of mesenchyme could enhance the epithelial stem cell differentiation potential by co-culturing organoid-derived epithelial cells with dental mesenchymal stem cells. Development of this assembloid model required the design of a cell-layering approach and the optimization of culture medium that promotes growth of both cell types. Interestingly, ameloblast differentiation of the organoid-derived epithelial stem cells was triggered by the presence of the dental mesenchymal cells in the assembloids, and TGFβ signaling was found to be involved in this process, thereby corroborating in vivo findings of interactive mesenchyme-epithelium importance during tooth development and amelogenesis. Furthermore, when cultured in differentiation medium, ameloblast development was even more pronounced, again mediated by TGFβ signaling. Following in vivo transplantation, the differentiated assembloids deposited mineralized tissue similar to epithelial organoids. In addition, immunohistochemistry suggested pre-dentin deposits to be present within the assembloid grafts. In conclusion, we developed first-in-time organoid models derived from human tooth empowering the exploration of dental epithelial stem cell biology and function as well as the interplay with tooth mesenchyme, all at present only poorly defined in humans. Moreover, the new tools may pave the way to future tooth-regenerative perspectives to replace whole tooth or tooth parts.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

In 2015, it is estimated that worldwide 4.2 million people died prematurely because of the consequences of air pollution. Moreover, ambient pollution has been identified as the leading cause of the global disease burden. The core of atmospheric pollutant particles is represented by combustion-derived particles (CDPs), such as carbon black (CB) and black carbon (BC), which are produced during incomplete combustion processes of, for example, diesel fuel. Various studies indisputably demonstrated that exposure to CDPs is associated with a wide range of adverse health effects including, among others, cardiovascular and pulmonary diseases as well as lung cancer. Recent investigations have even promulgated this type of particles to be more harmful to the human health than other subcomponents of particulate air pollution. Although great progress has been made in comprehending the interactions of CDPs with biological systems, improved methods to probe these particles in complex environments and to gain detailed information about their corresponding adverse impact, are still needed. Hence, this dissertation focused on the persisting demand of analytical techniques for the qualitative and quantitative determination of carbonaceous particles in biologically relevant samples. Consequently, two novel optical-based analytical methods were developed using white-light generation under femtosecond pulsed laser illumination and pump-probe imaging. Both techniques were evaluated in various complex biological environments, such as human lung fibroblasts and urine samples. These results clearly showed that both techniques have numerous advantages over existing technology as these are label-free, biocompatible and straightforward approaches that discriminate background signals from biological components and can be easily combined with various fluorochromes. Furthermore, it was shown that both techniques can be employed to measure black carbon particles in urine and that urinary loading can serve as an exposure matrix to CDP-based air pollution, reflecting the passage of black carbon particles from circulation into urine. Additionally, advances were made in the field of displacement microscopy by making the quantification of large cell-induced deformations possible and by studying these displacements in a label-free manner using second harmonic generation (SHG) from collagen fibrils instead of the traditionally used fiducial markers. In this dissertation, this advanced method has been employed to elucidate the toxicological effects of carbonaceous particles, which proved that those particles can inhibit lung fibroblast-mediated matrix remodeling via an oxidant-dependent mechanism. During the past four years, great advances have been made but we are not there yet. First of all, in light of our patent application, an automatized, prototype set-up needs to be built to make high-throughput screening of biological samples possible. Secondly, additional toxicological studies should be performed to answer crucial questions about particle internalization and co-localization inside cellular organelles and to confirm the proposed oxidant-dependent pathway. Thirdly, epidemiological studies should be set-up to closely study the effect of carbon-based materials on human health and golden standards based on optical microscopy should be re-evaluated. In summary, the two optical-based analytical techniques and advanced displacement microscopy method described in this dissertation pushed the boundaries of toxicological and epidemiological studies to the next level and opened doors to many new opportunities in both fundamental and applied research. We believe that eventually these contributions will result in an improved understanding of the specific toxicology effects of CDPs and direct associations of those particles with adverse health effects. It might even lead to novel or additional indicators for more precise air quality strategies and regulatory proposals.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Het beoordelen van de kwaliteit van kaakbot heeft een breed toepassingsveld, bijvoorbeeld bij preoperatieve planning van implantaten of het opvolgen van botveranderingen onder invloed van ziekteprocessen of therapeutische handelingen. Klinisch bruikbare methodes voor het objectief kwantificeren van kaakbotkwaliteit zijn eerder schaars en vaak niet gevalideerd. Het hoofddoel van deze thesis was dan ook het ontwikkelen en valideren van een objectieve, klinisch bruikbare methode voor het evalueren van botkwaliteit. Aanvankelijk werden panoramische radiografieën gebruikt voor het beoordelen van kaakbotkwaliteit en de mogelijkheid om met deze informatie de mate van marginaal botverlies te voorspellen (Hoofdstuk 2). Botkwaliteit werd beoordeeld op basis van grijswaarden en met behulp van een botkwaliteitsindex. De gevonden densiteit bleek in zekere mate het alveolaire botniveau te beïnvloeden. Toch werden we met de methodologische beperkingen van panoramische radiografieën geconfronteerd, zoals de geometrische vervorming en spatiale resolutie. De methode voor het evalueren van botkwaliteit werd vervolgens gezocht bij intra-orale radiografieën. Om een objectieve waarde te bekomen werd een aluminium wig als referentie op de beeldreceptor geplaatst. Dit had praktische gevolgen voor de geplande klinische studies. Daarom werd in Hoofdstuk 3 bekeken of en bevestigd dat dergelijke wig werkelijk een meerwaarde bood. Densiteitsbepalingen waren reproduceerbaar, zowel met als zonder de wig, maar de resultaten met de wig waren veel accurater voor het inschatten van de werkelijke densiteit. Na deze eerste exploratie werd de methode verder ontwikkeld en gevalideerd in Hoofdstuk 4. Accuraatheid en precisie werden nagegaan bij een in vitro studie set-up. Daarnaast werd de detectiedrempel voor botveranderingen bepaald. De methode bewees bruikbaar te zijn voor het meten van botdensiteit en het opvolgen van kleine veranderingen daarin en werd vervolgens in een in vivo studie toegepast. Hoofdstuk 5 beschrijft deze klinische studie, die werd opgestart met als doel het identificeren van personen met osteoporose met behulp van kaakbotdensiteitsmetingen. De diagnostische waarde van de densiteitsmetingen op kaakbot was goed. Gebaseerd op dezelfde populatie werd in Hoofdstuk 6 de invloed van alcohol consumptie op kaakbot onderzocht. We vonden een lagere densiteit en een lagere mandibulaire corticale dikte bij personen met een hoge alcoholconsumptie, en bij oudere personen. Een volgende toepassing bestond erin de impact van therapie voor parodontitis te evalueren door het opvolgen van botdensiteit (Hoofdstuk 7). Het betrof een studie naar het effect van beneficiële microbiota in een hondenmodel. Hoewel de studiepopulatie bescheiden was, werd de waarde van de methode voor het opvolgen van kleine botdensiteitsveranderingen duidelijk. De ontwikkelde methode bewees haar nut voor het objectief beoordelen van kaakbot. Hierbij dient opgemerkt dat soms ook structurele karakteristieken van het bot nodig zijn voor het correct inschatten van klinische situaties. Met het oog op de toekomst voerden we in Hoofdstuk 8 een validatiestudie uit om na te gaan hoe de densiteit op intra-orale radiografieën gecorreleerd was met de botstructuur op microscopische beelden. De densiteit toonde een hoge correlatie met structurele eigenschappen zoals de relatieve botoppervlakte en de corticale breedte. The assessment of jaw bone quality has a broad field of potential applications, such as preoperative planning of implant placement or the follow-up of bone changes as a result of progression of disease or therapy. Clinical tools for objective quantification of jaw bone quality are sparse, and often not validated. Therefore, the overall aim of this thesis was to develop and validate an objective, clinically applicable tool for jaw bone quality evaluation. Initially, panoramic radiographs were used for assessing jaw bone quality and its predictive value for the degree of marginal bone loss (Chapter 2). Bone quality was assessed by radiographic density and a bone quality index. Although radiographic density of alveolar bone was associated with periodontal bone level to some extent, we were confronted with some methodological constraints of the use of panoramic radiographs, such as geometrical distortion and spatial resolution. The search for a bone density evaluation tool was continued using intra-oral radiographs. For objective quantification, an aluminium stepwedge was chosen as a reference on the radiographs. This had practical consequences for the planned clinical studies which is why, in Chapter 3, the benefit of using such a stepwedge was explored and confirmed. Densitometric assessment showed good reproducibility for the analyses with and without aluminium wedge correction, but the assessment was far more accurate when the wedge was included. After this initial justification, the tool was further developed and validated in Chapter 4. Accuracy and precision were determined in an in vitro study. The minimal detection threshold was also determined. The tool showed potential for bone density evaluation to monitor minute bone changes and was subsequently applied in an in vivo study. Chapter 5 describes this clinical study, which was set up to identify persons with osteoporosis using the tool for jaw bone densitometry on intra-oral radiographs. A fair diagnostic accuracy for osteoporosis in the hip or spine was obtained. Based on the same population, in Chapter 6, the influence of one specific lifestyle factor on the jaw bone, was explored: alcohol consumption. We found a reduced density and mandibular cortical thickness in persons with increased alcohol consumption, as well as in older individuals. For another in vivo application of the tool (Chapter 7), we evaluated the impact of replacement therapy by monitoring bone density changes and alveolar bone level in periodontal pockets in a dog model. Although in a small sample, we could appreciate the value of the densitometric tool as a follow-up instrument for detecting small changes in bone density. The densitometric tool for jaw bone has proven its use in the objective assessment of bone. It must be added that it might be necessary to obtain more specific information on the structural properties of bone to correctly interpret certain clinical situations. With a look into the future, we performed a study in Chapter 8 to obtain an idea on how the density on radiographs was correlated to the bone structure on microscopy. The density derived from periapical radiographs showed good correlation with bone structural characteristics, such as bone area and cortical width. Het beoordelen van de kwaliteit van kaakbot heeft een breed toepassingsveld, bijvoorbeeld bij preoperatieve planning van implantaten of het opvolgen van botveranderingen onder invloed van ziekteprocessen of therapeutische handelingen. Klinisch bruikbare methodes voor het objectief kwantificeren van kaakbotkwaliteit zijn eerder schaars. Het hoofddoel van deze thesis was dan ook het ontwikkelen en valideren van een objectieve, klinisch bruikbare methode voor het evalueren van botkwaliteit.De methode voor het evalueren van botkwaliteit werd gezocht bij intra-orale radiografieën. Een aluminium wig werd als referentie voor densiteit op de beeldreceptor geplaatst. Na enkele studies om de validiteit van de methode te analyseren werd ze klinisch toegepast. Deze klinische studie werd opgestart met als doel het identificeren van personen met osteoporose met behulp van kaakbotdensiteitsmetingen. De diagnostische waarde voor osteoporose detectie in heup of rug was gemiddeld. Ook de invloed van alcohol consumptie op kaakbot werd onderzocht. We vonden een lagere densiteit bij personen met een hoge alcoholconsumptie, en bij oudere personen. Bij een studie over probiotische therapie bij de behandeling van parodontitis, zagen we de waarde van onze methode voor het opvolgen van kleine veranderingen in botdensiteit. In de eindfase van de thesis werd geëalueerd hoe de densiteitswaarden gerelateerd waren aan de botstructuur. De densiteit bleek een goede predictor voor bepaalde structurele karakteristieken. The assessment of jaw bone quality has a broad field of potential applications, such as preoperative planning of implant placement or the follow-up of bone changes as a result of progression of disease or therapy. Clinical tools for jaw bone quality assessment are sparse. Therefore, the overall aim of this thesis was to develop and validate an objective, clinically applicable tool for jaw bone quality evaluation.The search for a bone density evaluation tool was done using intra-oral radiographs. For objective quantification, an aluminium stepwedge was chosen as a density reference on the radiographs. After the initial exploratory studies to validate the tool, it was used in a clinical study. This was set up to identify persons with osteoporosis. A fair diagnostic accuracy for osteoporosis in the hip or spine was obtained. The influence of alcohol consumption on the jaw bone was also explored. We found a reduced jaw bone density in persons with increased alcohol consumption, as well as in older individuals. In a study on probiotic therapy for periodontitis, we could see the value of the densitometric tool as a follow-up instrument for detecting small changes in bone density. In a last phase, we evaluated how the densitometric results we obtained related to the actual bone structure. The density was a good predictor for some structural characteristics.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Rhizobium etli is een Gram-negatieve bodembacterie die in staat is om stikstof te fixeren tijdens symbiose met zijn gastheerplant Phaseolus vulgaris. Gedurende deze symbiose koloniseren rhizobia de wortels van hun gastheerplant waarbij ze de ontwikkeling van gespecialiseerde organen, wortelknolletjes genaamd, induceren. Binnen deze knolletjes differentiëren de bacteriën tot bacteroïden die gefixeerde stikstof leveren aan de gastheerplant in ruil voor koolstofbronnen. Een efficiënte symbiose vereist een extensieve moleculaire communicatie tussen plant en bacterie. Hoewel al veel onderzoek gewijd werd aan de initiële stappen van deze interactie, is er weinig geweten over de signalen die belangrijk zijn tijdens de latere stappen van de symbiose. Tijdens een genoomwijde screening voor nieuwe symbiotische genen in R. etli CNPAF512, werd een mutant in een vermeende oligopeptide ATP-bindingscassette (ABC) transporter geïdentificeerd. Deze mutant vertoonde in vergelijking met wildtype R. etli een significante reductie in stikstoffixatiecapaciteit, hetgeen een mogelijke rol voor peptidentransport tijdens symbiose suggereert. Deze studie had als doel de rhizobiële oligopeptide ABC-transporter te karakteriseren en, specifiek, zijn rol gedurende de symbiose met de gastheerplant P. vulgaris te onderzoeken. Oligopeptide ABC-transporters zijn transmembranaire multidomein transporters, betrokken bij de opname van oligopeptiden in de cel. De primaire en best gekende functie van dergelijke oligopeptidentransportsystemen in Gram-negatieve bacteriën is nutritioneel. De opname van kleine peptiden als nutriënt en het recycleren van celwandpeptiden voorzien de cel van energie en stikstofbronnen. Naast deze opname van nutriënten hebben de peptidentransporters ook nog andere functies zoals chemotaxis, chaperone-activiteit, de opname van heem, en osmoprotectie. Bovendien werd geopperd dat Gram-negatieve bacteriën, zoals reeds werd vastgesteld voor Gram-positieve bacteriën, gebruik maken van oligopeptide ABC-transporters om de locale omgevingscondities te registreren via binding en/of translocatie van signaalpeptiden. Duidelijk bewijs voor deze signaalfunctie ontbreekt vooralsnog. Tijdens deze studie werd de sequentie van de oligopeptide ABC-transporter (Opt) locus van R. etli CNPAF512 bepaald. Deze locus bevat acht genen, namelijk vier genen coderend voor de vier subeenheden van een oligopeptide ABC-transporter (Opt), een adenylaat cyclase gen ( cyaA) , twee genen homoloog aan redA (een vermeend glycosyltransferase) , en een redB gen (een vermeend glycosyltransferase). De vier subeenheden van de Opt-transporter omvatten een periplasmatisch substraatbindingseiwit (OptA), twee transmembranaire permease-eenheden (OptB en OptC) en een ATP-bindingseiwit dat twee ATPase-domeinen bevat (OptD). De vier genen die coderen voor deze vier subeenheden vertonen gelijkenis met gekende genen coderend voor oligopeptide, dipeptide en murein peptide ABC-transporters. Om de R. etli opt genen te karakteriseren, werden een aantal opt mutanten geconstrueerd en geëvalueerd, zowel in planta als tijdens vrijlevende condities. Planten geïnoculeerd met R. etli opt mutanten vertoonden een verminderde symbiotische stikstoffixatie-activiteit (reductie van ongeveer 50 %). Groeitesten uitgevoerd op opt mutanten in aanwezigheid van oligopeptiden als enige stikstofbron bevestigden dat de opt genen betrokken zijn bij de opname van oligopeptiden. Een verdere fenotypering van de opt mutanten maakte duidelijk dat zij ook een verhoogde resistentie vertonen tegen het oligopeptide antibioticum bacitracin, een verhoogde gevoeligheid vertonen voor het β-lactam antibioticum ampicilline en een verminderde osmotolerantie hebben. Dit toont aan dat het opt operon in R. etli van belang is voor resistentie tegen bepaalde vormen van stress. Een transcriptionele studie van de opt regio werd ook uitgevoerd. Via RT-PCR werd aangetoond dat de acht genen van de opt locus deel uitmaken van één transcriptionele eenheid. Door de constructie van gusA -reportergen fusies werd het expressiepatroon van drie mogelijke promoterregio's van het opt operon onderzocht. Alle drie de fusieconstructen vertoonden promoteractiviteit, zowel onder vrijlevende als symbiotische condities. Bovendien werd aangetoond dat de expressieniveaus afhankelijk zijn van de groeifase waarin de bacterie zich bevindt. Daarenboven werd het expressieniveau van één van de drie constructen significant geïnduceerd in complexe groeimedia. Aangezien oligopeptide ABC-transporters in verband worden gebracht met celwandrecyclage en met vele processen die mogelijk beïnvloed worden door modificaties in de structuur van peptidoglycaan, is de R. etli Opt transporter mogelijk betrokken bij het wijzigen van de celwandstructuur. In een preliminaire studie werd de structuur van R. etli peptidoglycaan geanalyseerd via LC-MS/MS. De data resulterend uit deze MS/MS analyse van R. etli muropeptiden bevestigen dat de peptidoglycaanstructuur van R. etli lijkt op de archetypische peptidoglycaanstructuur van Gram-negatieve bacteriën, nl. NAG-NAM-L-Ala-D-Glu-(γ)- m -Dap-D-Ala, en dat zowel m- Dap-D-Ala en m- Dap- m- Dap kruisverbindingen aanwezig zijn. Rhizobium etli is a Gram-negative root-colonizing soil bacterium capable of fixing nitrogen while living in symbiosis with its leguminous host Phaseolus vulgaris . During this symbiosis, rhizobia colonize the roots of their host, inducing the development of specialized organs, called root nodules. Inside these nodules differentiated bacteria, called bacteroids, exchange fixed nitrogen with the host in return for carbon compounds. An efficient symbiosis requires an extensive molecular communication between plant and bacteria. Although a lot of research has been devoted to the initial steps of the interaction, little is known about the signals which are important during the late steps of the symbiosis. In a genome-wide screening for novel symbiotic genes in R. etli CNPAF512, a mutant affected in a gene encoding a putative oligopeptide ATP-binding cassette (ABC) transporter was identified. This mutant showed a significant reduction in nitrogen fixation capacity compared to wild-type R. etli, suggesting a possible role for peptide transport during symbiosis. The goal of this study was to characterize this rhizobial oligopeptide ABC-transporter (Opt) and specifically investigate its role during symbiotic interactions with its host plant P. vulgaris (common bean). Oligopeptide ABC-transporters are multidomain transmembrane translocators involved in the uptake of oligopeptides into the cell. The primary and best known function of these oligopeptide transport systems in Gram-negative bacteria is nutritional. The uptake of small peptides as a nutrient and the recycling of cell wall peptides provide the cell with energy and nitrogen sources. Besides the mere uptake of nutrients, these peptide transporters have been ascribed additional functions like chemotaxis, chaperoning, heme uptake, and osmoprotection. Moreover, it has been suggested that Gram-negative bacteria, as has been established for Gram-positive bacteria, use oligopeptide ABC-transporters to sense local environmental conditions by binding and/or translocating signalling peptides, although clear evidence of this signalling function is still lacking. In this study, the opt locus of R. etli CNPAF512 was cloned and sequenced, revealing a R. etli genomic region containing eight genes: four genes encoding the four subunits of an oligopeptide ABC-transporter (Opt), an adenylyl cyclase gene ( cyaA), two redA homologous genes (putative glycosyltransferases), and one redB gene (a putative glycosyltransferase). The four subunits of the Opt-transporter include one periplasmic substrate-binding protein (OptA), two transmembrane permease subunits (OptB and OptC) and an ATP-binding protein, containing two ATPase domains (OptD). The four opt genes encoding these subunits resemble known genes encoding oligopeptide, dipeptide and murein peptide ABC-transporters. To functionally characterize the R. etli opt genes, several opt mutants were constructed and evaluated in planta and under free-living conditions. Plants nodulated by R. etli opt mutants showed a reduced symbiotic nitrogen fixation activity (approximately 50 % reduction). Growth experiments with opt mutants in the presence of oligopeptides as the sole nitrogen source confirmed the involvement of the opt genes in oligopeptide uptake. Further phenotypic analysis of the opt mutants revealed an enhanced resistance to the oligopeptide antibiotic bacitracin, an increased susceptibility to the β-lactam antibiotic ampicillin and a decreased osmotolerance, demonstrating a contribution of the opt operon to stress resistance in R. etli. A transcriptional study of the opt region was also performed. Using RT-PCR the eight genes of the opt locus were demonstrated to be part of one transcriptional unit. By constructing gusA reporter gene fusions, three putative promoter regions of the opt operon were evaluated for their expression patterns. All three fusion constructs were shown to possess promoter activity in both free-living and symbiotic conditions. Moreover, expression levels were demonstrated to be growth phase-dependent. In addition, the expression level of only one of the three constructs was significantly induced in complex growth media. Since oligopeptide ABC-transporters have been linked to cell wall recycling and to many processes which might be influenced by changes in peptidoglycan structure, the R. etli Opt transporter could be involved in modifying cell wall structure. In a preliminary study the structure of R. etli peptidoglycan was analysed using LC-MS/MS. Data resulting from this MS/MS analyses of muropeptide preparations of R. etli confirm that the peptidoglycan structure of this bacterium is similar to the archetypal peptidoglycan structure of Gram-negative bacteria, being NAG-NAM-L-Ala-D-Glu-(γ)- m -Dap-D-Ala, and that both m- Dap-D-Ala and m- Dap- m- Dap cross-linkages are present in R. etli peptidoglycan. Vlinderbloemige planten, en vooral de gewone boon (Phaseolus vulgaris), zijn belangrijke gewassen aangezien ze o.a. de belangrijkste bron van eiwitten vormen in de menselijke voeding in Afrika en Latijns-Amerika. Rhizobium etli is een bodembacterie die in staat is om knolletjes te vormen op de wortels van zijn gastheerplant Phaseolus vulgaris. Binnenin deze knolletjes vormt de bacterie atmosferische stikstof (N2) om tot ammonium wat als stikstofbron gebruikt kan worden door de plant. Dit proces wordt biologische stikstoffixatie genoemd en vormt een belangrijk voordeel voor de plant aangezien stikstof, na water en koolstofdioxide, het belangrijkste nutriënt is voor planten. Bovendien vormt stikstof vaak de limiterende factor in de groei van de plant. Planten zijn immers niet in staat om zelf atmosferische stikstof te gebruiken. Ook de bacterie Rhizobium etli haalt echter voordeel uit de interactie met de boon: in ruil voor de stikstof levert de plant koolstofbronnen aan de bacterie. Omdat beide partners voordeel halen uit deze interactie wordt ze ook symbiose genoemd. Aangezien een goede biologische stikstoffixatie de opbrengst van vlinderbloemige gewassen kan verhogen en bovendien kan bijdragen tot duurzame landbouw vormt de symbiose tussen Rhizobium etli en Phaseolus vulgaris reeds jaren een belangrijk onderzoeksdomein. De hier beschreven studie kadert in dit onderzoeksgeheel en focust zich op de bacteriële partner, meerbepaald op de rol van de rhizobiële oligopeptide ABC-transporter in de interactie tussen plant en bacterie. Tijdens een voorgaande studie naar genen die een sleutelrol spelen bij de late stappen van de symbiose werd een mutantenbank van R. etli geconstrueerd. Eén van de mutanten die werden geïdentificeerd bleek gemuteerd in een oligopeptide ABC-transporter (Opt). Deze mutant vertoonde in vergelijking met wildtype R. etli een verminderde stikstoffixatiecapaciteit. Op basis van deze resultaten werd besloten het Opt systeem te karakteriseren. In een eerste deel werd de sequentie bepaald van de genomische locus die het gemuteerde opt gen bevat. Deze locus bevat acht genen, waaronder vier (opt) genen coderend voor de vier subeenheden van een oligopeptide ABC-transporter (Opt). Om deze R. etli opt genen te karakteriseren, werden een aantal opt mutanten geconstrueerd en geëvalueerd, zowel op plant als tijdens vrijlevende condities. Planten geïnfecteerd met R. etli opt mutanten vertoonden een verminderde symbiotische stikstoffixatie-activiteit. Groeitesten uitgevoerd op opt mutanten in aanwezigheid van oligopeptiden als enige stikstofbron bevestigden dat de opt genen betrokken zijn bij de opname van oligopeptiden. Bovendien bleken de opt mutanten een verhoogde resistentie te vertonen tegen het oligopeptide antibioticum bacitracin, een verhoogde gevoeligheid te vertonen voor het β-lactam antibioticum ampicilline en een verminderde osmotolerantie te hebben. Dit toont aan dat de opt locus van R. etli van belang is bij verschillende vormen van stressrespons. Een transcriptionele studie van de opt regio werd ook uitgevoerd. Met behulp van reportergen fusieconstructen werd aangetoond dat de opt regio zowel tijdens vrijlevende als symbiotische condities tot expressie komt en dat de expressie groeifase afhankelijk is. Bovendien werden aanwijzingen gevonden voor een inducerende component. Aangezien oligopeptide ABC-tranporters in verband worden gebracht met celwandrecyclage en met vele processen die mogelijk beïnvloed worden door modificaties in de structuur van peptidoglycaan, is de R. etli Opt transporter mogelijk betrokken bij het wijzigen van de celwandstructuur. In een preliminaire studie werd de sturctuur van R. etli peptidoglycaan geanalyseerd via LC-MS/MS. De bekomen data bevestigen dat de peptidoglycaanstructuur van R. etli lijkt op de archetypische peptidoglycaanstructuur van Gram-negatieve bacteriën.