Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Colitis ulcerosa is een chronisch inflammatoire darmziekte gekenmerkt door continue inflammatie in de mucosa van het rectum en het colon. De oorzaak van deze ziekte is nog niet volledig duidelijk, al is er wel een vermoeden dat omgevingsfactoren en genetische voorbeschiktheid aan de basis van het ontstekingsproces kunnen liggen. Afhankelijk in welke delen van het colon de ontsteking zich bevindt, kan de ziekte onderverdeeld worden in proctitis, linkszijdige colitis en pancolitis. De diagnose van de ziekte wordt met klinisch, endoscopisch en histologische technieken tot stand gebracht. De meest gebruikte endoscopische beoordelingsscore is de Mayo score, voor de histologische beoordeling gebruikt men de Geboes score bij klinische trials. Het doel van deze retrospectieve, observationele studie is de bestaande Geboes score om te vormen tot een vereenvoudigde Geboes score en deze score vervolgens te valideren. Deze voorgestelde simplificatie is eerder samengesteld door Prof. Dr. Geboes. De originele Geboes score bevat zes graden die elk onderverdeeld zijn in subgraden, de nieuwe versie van de Geboes score bevat slechts vijf graden door combinatie en recombinatie van (sub)graden, zodat deze score gemakkelijker is in gebruik. Ons voorstel voor de vereenvoudigde Geboes score wordt gevalideerd aan de hand van 343 biopsiesets van 103 patiënten met colitis ulcerosa. Deze worden geëvalueerd door vier verschillende observatoren (1 ervaren patholoog en 3 onervaren observatoren) geblindeerd voor klinisch en endoscopische gegevens. Vervolgens gaat men de resultaten van beide histologische scoringssystemen vergelijken met de endoscopische Mayo score en ziet men dat de vereenvoudigde Geboes score een even sterke correlatie toont als de originele Geboes score. De herhaalbaarheid wordt nagegaan door het resultaat van de scores tussen twee observatoren (telkens één ervaren en één onervaren) te vergelijken. Men kan hieruit besluiten dat de reproduceerbaarheid van de originele Geboes score en de vereenvoudigde Geboes score gelijkwaardig is. Door de parameter frequenties, de associaties tussen verschillende parameters en de parameter combinaties te vergelijken kan men zien dat de vereenvoudigde Geboes score op een gelijkwaardige manier resultaten van de originele Geboes score weergeeft. Uit de resultaten van de validatie kan geconcludeerd worden dat de vereenvoudigde Geboes score gelijkwaardig is aan de originele Geboes score. Hierdoor is de basis gelegd dat de vereenvoudigde Geboes score de originele Geboes score kan vervangen.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Tubereuze Sclerose (TSC) is een weesziekte die gekarakteriseerd wordt door de vorming van goedaardige tumoren in verschillende organen. TSC wordt veroorzaakt door een loss-of-function mutatie in het TSC1 of TSC2 gen, welke respectievelijk voor hamartin en tuberin coderen. Door deze mutatie is de mTOR pathway overgeactiveerd wat kan leiden tot onder andere neurologische afwijkingen. Het doel van deze thesis was het verder karakteriseren van het tsc2 ENU gemuteerd zebravismodel met het fenotype van de patiënten in het achterhoofd. Daarbij werd gefocust op de afwijkingen in het centraal zenuwstelsel. Om na te gaan of ons tsc2 zebravismodel een geschikt model was van TSC voor verdere experimenten werd het eerst gevalideerd. Dit gebeurde door met behulp van western blot na te gaan of de mTOR pathway overgeactiveerd was in de mutante zebravis larven. Aansluitend werd een screening uitgevoerd om de morfologie van de verschillende genotypen te karakteriseren. Daaropvolgend werden de hersenen onderzocht aan de hand van twee verschillende methodes: de grootte van het hoofd en de hersenen werd bepaald en in verband gebracht met respectievelijk macrocefalie en megalencefalie. Vervolgens werd de levensvatbaarheid van de larven bepaald aan de hand van een survival curve. Als laatste werd de beweging van de larven onderzocht met behulp van een geautomatiseerd tracking toestel. Dit werd onderzocht omdat een verandering in beweging mogelijk een eerste teken van epileptiforme activiteit is. De Western blot toonde aan dat het tsc2 zebravismodel een geschikt model is om TSC verder te kunnen karakteriseren. Vervolgens kon er aangetoond worden dat de homozygote larven zowel macrocefalie als megalencefalie vertoonden. Er werd ook vastgesteld dat de homozygoten sneller sterven. Als laatste werd ook aangetoond dat de homozygote larven een verschil in locomotor activiteit vertoonden. Dit verschil was te vinden in de totale beweging in het donker, de totale beweging over tijd in een licht/donker cyclus en de beweging na de overgang van licht naar het donker in een licht/donker cyclus. De resultaten tonen aan dat het tsc2 ENU gemuteerd zebravismodel een veelbelovend genetisch model is voor TSC. Het fenotype van de patiënt kan nagebootst worden in de zebravis en andere experimenten kunnen nog worden uitgevoerd om het model verder te karakteriseren. De conclusie is dat de locomotor activiteit een veelbelovende techniek is om epileptiforme activiteit aan te tonen en verder gebruikt kan worden om te screenen voor nieuwe geneesmiddelen.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Over peroxisomen wordt nog veel onderzoek gedaan aangezien er nog veel vragen zijn over deze organellen en hun functies in de cellen. Hun belangrijkste functie is de β-oxidatie van lange ketenvetzuren, vertakte keten vetzuren en poly-onverzadigde vetzuren. Bij de peroxisomale β-oxidatie komt er H2O2 vrij, die wordt afgebroken door catalase tot H2O en O2. Wat echter ontdekt werd, is dat de peroxisomen in de β-cel van de pancreas een heel lage hoeveelheid catalase bevatten. Over de rol van peroxisomen in deze insuline producerende cellen, is echter nog weinig bekend. De eerste doelstelling van deze thesis was om na te gaan of het aantal peroxisomen in β-cellen wijzigt in stresssituaties, zoals bij zwangerschap en blootstelling aan een vetrijk dieet. De peroxisomen van gedispergeerde β-cellen uit geïsoleerde eilandjes van enerzijds zwangere muizen en niet-zwangere muizen en anderzijds muizen op een vetrijk dieet en muizen op een normaal dieet werden gekleurd met anti-PEX14 antistof of anti-PMP70 antistof. Daarna werd het aantal peroxisomen per cel en de grootte van de β-cel vergeleken. Uit de test voor zwangerschap kon besloten worden dat er een verschil is in grootte van de cellen gedurende de zwangerschap. Uit de test met de blootstelling aan een vetrijk dieet bleek dat zowel het aantal peroxisomen als de grootte van de cellen toenam indien de muis op een vetrijk dieet gezet werd. Een tweede vraag die gesteld wordt in deze thesis is wat het belang is van de peroxisomen in insuline producerende cellen. Hiervoor werden RIP-Pex5 knock-out (KO) muizen gegenereerd, waarbij het Pex5 gen uitgeschakeld is in de β-cellen. PEX5 is een peroxine dat belangrijk is voor de import van matrixproteïnes in de peroxisomen. Indien PEX5 uitgeschakeld wordt, kunnen de peroxisomen hun functie niet meer uitoefenen en kunnen veranderingen in deze RIP-Pex5 KO muizen toegeschreven worden aan deze niet-functionerende peroxisomen. Er werd reeds in het verleden gezien dat RIP-Pex5 KO muizen, blootgesteld aan een vetrijk dieet, een afgenomen β-cel massa hebben vergeleken met de controle muizen die hetzelfde voedingspatroon volgden. Om hiervoor een verklaring te vinden, kleurden we coupes van pancreasweefsel met geactiveerd caspase 3. Dit om na te gaan of er meer celdood optreedt, wat het geval niet bleek te zijn. Omdat ook mitochondriën een belangrijke rol spelen in de oxidatie van vetzuren en de vorming van reactieve zuurstofdeeltjes (ROS), behandelden we gedispergeerde cellen van geïsoleerde eilandjes met chemische probes om veranderingen in ROS productie na te gaan, en dit zowel bij laag (5 mM) als hoog (20 mM) glucosegehalte. De kleuring met MSR voor mitochondriale superoxideproductie, toonde geen verschillen tussen KO en controle muizen. De kleuring met CM-H2DCFDA voor cytosolisch superoxide gaf aan dat bij hyperglycemie, er meer cytosolisch superoxide aanwezig is. Er waren echter geen verschillen tussen KO en controle muizen. Ten laatste kleurden we ook voor de mitochondriale membraanpotentiaal met TMRM, dat een goed beeld geeft van mitochondriale defecten. Bij hyperglycemie was de potentiaal gestegen en ook bij KO muizen nam de potentiaal toe.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

De hypofyse, gelegen onderaan de hersenen, vervult een cruciale functie in de regulatie van het endocrien stelsel. Deze ‘meesterklier’ stuurt fundamentele processen aan, waaronder groei, voortplanting, immuunrespons, metabolisme en stressrespons. Wanneer de hypofyse onvoldoende hormonen produceert (o.a. door beschadiging), ontstaan ernstige pathologieën. De behandeling, levenslange hormoonsubstitutie, is suboptimaal omdat het fysiologisch pulsatiel secretiepatroon van de hypofyse hiermee niet nagebootst kan worden, en de toegediende hormonen belangrijke nevenwerkingen veroorzaken. Herstel van het beschadigd hypofyse-weefsel en/of haar functie is een aantrekkelijk alternatief. De recente ontdekking van hypofyseherstel na schade is een eerste stap in deze richting. Tijdens dit regeneratieproces zijn de lokale stamcellen geactiveerd. Om meer kennis te verwerven over de mechanismen van hypofyse-regeneratie en de rol van stamcellen in dit proces, wordt in het labo een nieuw hypofyse in vitro model, met name organoïden, ontworpen. Deze 3D structuren ontwikkelen zich in vitro onder WNT-activerende condities, en weerspiegelen het weefsel van herkomst. Deze thesis onderzocht methoden om organoïde-vorming meer efficiënt te maken en ze (langer) in cultuur te houden. Verder gingen we ook na of de organoïden een hypofyse-fenotype vertonen en kunnen gestimuleerd worden tot verdere hypofysecel-differentiatie. Organoïden werden ontwikkeld vanuit zowel normale als beschadigde hypofyse (waarin de stamcellen zijn geactiveerd), door gebruik te maken van een specifiek groeimedium met o.a. de WNT-activatoren WNT3A en RSPO1. Opvallend was dat de organoïden afkomstig van beschadigd hypofyse-weefsel hun groeicapaciteit na enkele weken verliezen terwijl de organoïden van onbeschadigd weefsel maanden in cultuur kunnen worden gehouden. De organoïden van beschadigd weefsel zijn eerder cysteachtig, waar de organoïden van onbeschadigd weefsel meer dens zijn. Om de vormingsefficiëntie van organoïden te verhogen, werd er gestart van hypofyse(stam)celclusters i.p.v. enkelvoudige cellen, maar er werden nauwelijks organoïden bekomen. Vervolgens werd de invloed van meerdere groeifactoren, in het bijzonder van WNT3A en RSPO1, nagegaan. RSPO1 bleek essentieel voor organoïde-expansie vanuit de beschadigde hypofyse, terwijl noch RSPO1, noch WNT3A nodig bleken voor de expansie van de ‘normale’ organoïden. Ten slotte werd met RT-qPCR en immunofluorescentie gevonden dat de organoïden een immatuur hypofyse-fenotype vertonen, en dat differentiatie tot hormonale cellen kan geïnduceerd worden. Verdere karakterisering en optimalisering van het hypofyse-organoïde-model zal uiteindelijk leiden tot een krachtig nieuw in vitro model voor het ontrafelen van biologie, pathologie en regeneratie van dit orgaan. De bevinding dat hormonale cellen kunnen gevormd worden is veelbelovend in de zoektocht naar een betere behandeling voor hypofysedeficiëntie (zoals celtherapie).

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Méér dan 100 herpesvirussen werden doorheen de jaren reeds geïsoleerd, maar van deze 100 herpesvirussen zijn er slechts acht (HSV-1, HSV-2, VZV, HCMV, HHV-6, HHV-7, EBV en HHV-8) relevant voor de mens. Een belangrijke eigenschap van de Herpesviridae familie is dat wanneer zij eenmaal een gastheer geïnfecteerd hebben, zij hier altijd latent aanwezig zullen blijven. Reactivatie van deze virussen kan zich dan voordoen wanneer het immuunsysteem van de gastheer zwakker is dan normaal(1),(2). Bij immuungedeprimeerde patiënten (bijvoorbeeld patiënten met een orgaan- of beenmerg-transplantatie, een primaire immunodeficiëntie, patiënten onder immunosuppresieve therapie) is een verlengde behandeling met antivirale geneesmiddelen vaak noodzakelijk door hun verzwakt immuunsysteem. Hierdoor kunnen er mutaties ontstaan in bepaalde virale genen zodat de patiënt niet meer op de antivirale therapie reageert. De toename in resistentie tegen antivirale geneesmiddelen kan vandaag de dag niet meer genegeerd worden. Stalen van patiënten worden opgestuurd naar de RegaVir groep om de gevoeligheid of resistentie van de herpesvirussen te bepalen tegen verschillende antivirale geneesmiddelen zoals Acyclovir, Penciclovir, Ganciclovir. Zo worden enerzijds de virale genen, die verantwoordelijk zijn voor het activeren van antivirale geneesmiddelen (thymidine kinase (TK) en proteïne kinase (PK)) en het target van het antiviraal geneesmiddel (DNA-polymerase (DP)), gesequenced met behulp van de standaard Sanger sequencing methode om mutaties te kunnen detecteren. Anderzijds, indien mogelijk, wordt met behulp van een fenotypering de gevoeligheid van het virus ten opzichte van een aantal antivirale geneesmiddelen in verschillende concentraties bepaald. In een korte tijdspanne (15 weken) konden 52 pa verschillende testen uitgevoerd. 68 % van deze virustesten resulteerde in wild type virussen en bij tien stalen werd een mutatie gevonden. Van deze tien mutaties waren er zes mutaties die reeds gekend waren en vier ongekende, niet eerder beschreven mutaties. 14 % van de virustesten was negatief. Voor zes stalen kon een succesvolle fenotypering uitgevoerd worden. Next Generation Sequencing (NGS) is een vernieuwde techniek waarbij virale variaties tot op 1 % gedetecteerd kunnen worden. Op deze manier worden ook de viruspopulaties die in een laag percentage aanwezig zijn gedetecteerd. Bij het bekijken van de resultaten van het NGS project werd de nadruk gelegd op de evaluatie van de virale heterogeniciteit in functie van de tijd en in verschillende lichaamsdelen. Hiervoor werd gebruik gemaakt van vijf verschillende Varicella-zoster virusstalen (VZV) afkomstig van twee verschillende patiënten. Deze stalen werden geselecteerd voor NGS omdat er in verschillende stalen van éénzelfde patiënt, op verschillende data gedurende de antivirale behandeling genomen, andere mutaties gedetecteerd werden. De mutaties en polymorfismen bekomen bij het sequencen van deze vijf VZV-stalen waren gelijk aan deze die reeds eerder met de Sanger sequencing methode gedetecteerd werden. De mutatie (del. AT Nts. 642-643) in het staal RV_337 werd met behulp van de Sanger sequencing methode als een pure mutatie gedetecteerd, terwijl deze met de NGS techniek als een mixed populatie gedetecteerd werd.