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Survivin is an anti-apoptotic protein that belongs to the IAPs (Inhibitor of Apoptosis Proteins) family and controls mitosis.
By alternative splicing, the survivin gene generates two variants : survivin 2B and survivin 3. According to the literature, surviving and its isoforms are strongly expressed during foetal development and also in tumor cells, but they are not expressed in healthy tissues except in thymus and placenta. It has been published that the surviving and its variants produce antigens recognized by cytolitic T lymphocytes that could be used in cancer immunotherapy.
The goal of this work was to measure by quantitative RT-PCR the level of expression of surviving and its variants in normal tissues, tumor lines and tumor clinical sample to evaluate the feasibility of an immunotherapy directed against antigens derived from surviving or its variants. Our results show a high level of expression of surviving and its isoforms in normal cells with a high mitotic index, a level of expression that is similar to that observed in tumor cells.
The second part of this work is an attempt to study the methylation of the promoter of the surviving gene. The methylation status of this promoter in healthy and tumor cells is debated in the literature. In order to clarify this point, we quantified transcripts of surviving and its isoforms in B and T lymphocytes before and after treatment with azadeoxycytidin, a demethylating agent. The results obtained did not allow us to conclude if the promoter was methylated or not in these cells La survivine est une protéine anti-apoptotique appartenant à la famille des IAPs (inhibitors of apoptosis proteins) et régulant la mitose. Grâce à un épissage alternatif, le gène de la survivine génère deux autres formes de la survivine : la survivine 2B et la survivine 3. Selon la littérature, la survivine et ses isoformes seraient fortement exprimées au cours du développement fœtal ainsi que dans les cellules des tissus sains. On a publié que la survivine et ses variantes produisent des antigènes reconnus par des lymphocytes T cytolytiques qui pourraient être utilisés en immunothérapie anti-tumorale.
L’objet de ce mémoire est de mesurer par RT-PDR quantitative le niveau d’expression de la survivine et de ses variants au sein des tissus normaux, des lignées tumorales et des échantillons cliniques de tumeurs pour évaluer les danger d’une immunothérapie dirigée contre les antigènes provenant de la survivine et de ses variants. Les résultats de cette étude montrent un haut niveau d’expression de la survivine et de ses isoformes dans les cellules normales à index mitotique élevé, un niveau d’expression qui est souvent comparable à celui des cellules tumorales.
Une seconde partie du mémoire est consacrée à l’étude de la méthylation du promoteur du gène de la survivine. En effet, l’état de méthylation du gène de la survivine dans les cellules saines et les cellules tumorales est controversé dans la littérature. Pour clarifier l’état de méthylation du promoteur, on a quantifié l’abondance des ARNm de la survivine et de ses isoformes dans des lymphocytes B et T avant et après traitement avec un agent déméthylant, l’azadéoxycytidine. Les résultats obtenus ne nous permettent pas de conclure que le promoteur et méthylé ou pas

RNA, Messenger --- Methylation --- Cells

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« À l'heure où nous écrivons ces mots, une véritable course contre la montre est en train de se jouer tout autour du globe, dont les principaux protagonistes sont, d'un côté, le Sars-CoV-2 et, de l'autre, les chercheurs - et tout spécialement ceux spécialistes des vaccins à ARN messager. L'histoire de ces vaccins inédits est avant tout européenne, grâce aux travaux décisifs de chercheurs allemands et français, commencés dès 1993 et poursuivis jusqu'à nos jours. Contre la pensée unique ambiante, ces chercheurs ont en effet imposé un nouveau concept thérapeutique, en définissant les clés biotechnologiques qui allaient ouvrir la voie à la préparation de l'ARN messager thérapeutique dans la lutte contre les cancers et les infections virales. Toutefois, revues scientifiques et leaders d'opinion américains taisent cette vérité. En s'appuyant sur le succès incontestable des vaccins anti-Covid mis sur le marché par Pfizer et Moderna, ils donnent une vision clairement déformée de l'histoire de ces nouveaux vaccins. Face à cette manipulation - voire cette usurpation - il est grand temps que les Européens rétablissent la vérité, en rappelant le rôle essentiel qui a été le leur dans la mise au point des vaccins à ARN messager. C'est cela, et bien d'autres choses encore, que ce livre s'attache à nous faire découvrir, et toujours à partir de sources objectives. Parsemé de données captivantes et pimenté de dessins humoristiques, cet ouvrage s'adresse aux scientifiques comme au grand public. »--Quatrième de couverture.

RNA, Messenger --- history.

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« ARN messager, PCR, dexaméthasone » : trois entités que la Covid-19 a projetées sous les feux de l'actualité. Revenant sur leur découverte, l'auteur divulgue des étapes cruciales dans la compréhension du contrôle de l'expression des gènes. En compagnie de pionniers de cette conquête, il nous conduira sur les traces d'un espion, sur celles de crapauds géants, et dans une base secrète nazie. Nous voyagerons au Mexique et en Papouasie, et serons au Chili lors du Coup d'État. Nous vivrons une nouvelle ruée vers l'or en Californie à l'aube de la biotechnologie où se croisent idéalistes, aventuriers et entrepreneurs. Les anecdotes cocasses ou dramatiques qui jalonnent le récit et révèlent le dessous des cartes animent une saga humaine et scientifique qui a repoussé les limites de la médecine moderne.

Covid-19 --- RNA, Messenger --- Polymerase Chain Reaction --- COVID-19

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T cells directed against tumor-associated antigens can be detected in several types of cancers, including melanoma. Cytotoxic T lymphocytes recognize antigens at the surface of tumor cells and therefore can induce the lysis of those cells. The genes coding for some of these antigens have been identified : they are differentiation genes and are expressed also in normal melanocytes. They encode the tyrosinase, the tyrosinase related proteins 1 and 2, Melan-A/MART1 or gp100/PMEL17.
However, some tumor cells reduce the expression of these antigens and then evade the anti-tumoral immunity. In melanoma cells cultivated in the presence of IL-1, several experiments have shown a decrease in the expression of these differentiation genes and of the transcription factor MITF-M (Microphtalmia-associated transcription factor), which regulates them. It can be suggested that this cytokine, present in the tumoral environment, may be responsible for the decrease in the expression of differentiation antigens and, therefore, favour the escape of tumor cells from the immune system. But, the mechanism used by IL-1 to induce this repression is still unknown. The aim of this work was to study this mechanism.
The first step was to test whether IL-1 acts on the MITF-M promoter or on the mRNA stability. We performed plasmid constructions with the MITF-M promoter (15 kb or 4,5 kb) upstream the luciferase gene and we measured the luciferase activity in the presence or not of IL-1. These experiments do seem not to implicate the promoter in the repression induced by this cytokine.
Then we have tried to evaluate whether there was an instability of the MITF-M mRNA and we expressed plasmid constructs in different tumor cell types (melanomas LB 2259 and LAGI and neuroblastoma SKNBE2) to determine the exact region of the mRNA that can be a target for the signal induced by IL-1. We perfomed constructs with the complete cDNA of MITF or only with the 3’UTR because this region is particulary long (3 kb) and can be responsible for transcript instability. However, although we could not identify the exact region implicated in this regulation, we concluded from our data that the 3’UTR alone was not capable to destabilize the transcript in the presence of IL-1ß.
LB 2259 melanoma cells were also incubated with transcription inhibitors and IL-1 to study MITF-M mRNA decay. These experiments allowed us to conclude that IL-1 does not directly influence MITF-M mRNA stability but promotes the transcription of factors responsible for the decrease in MITF mRNA levels Il a été mis en évidence dans certains types de cancer, dont les mélanomes, qu’il pouvait exister une réponse immunitaire anti-tumorale. Cette réponse est principalement médiée par des lymphocytes T cytolytiques (CTL) capables de reconnaître des antigènes à la surface des cellules de mélanome et d’induire la lyse de ces cellules. Les gènes codant certains de ces antigènes ont été identifiés : il s’agit de gènes exprimés également dans les mélanocytes normaux et qui sont impliqués dans la différenciation des mélanocytes. Ils codent la tyrosinase, les « tyrosinase related proteins », Melan-A/MART1 ou gp100/PMEL17.
Cependant, certaines cellules tumorales vont pouvoir échapper à la réponse immunitaire en réprimant l’expression de ces antigènes de différenciation. Des expériences préalables ont permis d’observer une diminution de l’expression de ces antigènes de différenciation ainsi que d’un facteur de transcription qui les régule, MITF-M (Microphtalmia-associated transcription factor), dans des mélanomes cultivés en présence d’IL-1. Ceci pourrait suggérer que cette cytokine, présente dans l’environnement de la tumeur, serait responsable de la diminution d’expression des antigènes de différenciation et donc de l’échappement à la réponse immunitaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’IL-1ß induit cette répression est encore mal connu. Le projet de ce mémoire est d’étudier ce mécanisme.
Une première étape était de savoir si l’IL-1 agit au niveau du promoteur du gène ou au niveau de la stabilité de l’ARNm. Nous avons donc réalisé des constructions contenant le promoteur du gène MITF-M (15 kb ou 4,5 kb) en amont du gène de la luciférase et mesuré l’activité luciférase en présence ou non d’IL-1. Ces expériences ne semblent pas indiquer que le promoteur soit impliqué dans la répression induite par cette cytokine.
Ensuite, pour mettre en évidence une instabilité du transcrit MITF, nous avons réalisé différentes constructions dans plusieurs lignées cellulaires (mélanomes LB 2259 et LAGI et neuroblastome SKNBE2) afin de déterminer la région exacte du transcrit ciblée par l’IL-1ß. Nous avons réalisé des constructions contenant l’ADNc complet de MITF ou uniquement la région 3’UTR étant donné que celle-ci est particulièrement longue (3 kb) et pourrait donc réguler la stabilité du transcrit. Cependant, nous n’avons pas encore pu identifier la région précise impliquée dans cette régulation, la région 3’UTR seule n’étant pas capable d’induire une déstabilisation en présence d’IL-1.
De plus, la lignée de mélanome LB2259 a été cultivée en présence d’inhibiteurs de transcription et d’IL-1, afin d’étudier la vitesse de dégradation de l’ARNm de MITF-M dans différentes conditions. Ceci a permis de conclure que l’IL-1 n’influence pas directement la stabilité de l’ARNm de MITF-M mais favoriserait la transcription d’intermédiaires responsables de la diminution des taux d’ARNm

Microphthalmia-Associated Transcription Factor --- T-Lymphocytes, Cytotoxic --- Interleukin-1beta --- RNA, Messenger --- Melanoma

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L’ARN messager a été découvert au tout début des années 1960 par François Jacob, Jacques Monod et Sydney Brenner. Il a valu aux deux premiers le prix Nobel. Au cours de l’année 2020, alors que l’humanité tout entière était menacée par le Covid-19, on a découvert et mis au point, en à peine dix mois, une série de vaccins utilisant précisément cet ARN messager et offrant l’espoir de sortir de cette terrible pandémie. Ce livre est le premier à raconter cette extraordinaire aventure non seulement scientifique, technologique et industrielle, mais aussi humaine. Fabrice Delaye en a rencontré les acteurs importants – plus de quarante, dont Stéphane Bancel, le patron de Moderna, Ingmar Hoerr, le fondateur de CureVac, Kati Karikó, la chercheuse à l’origine du vaccin de Pfizer-BioNTech, et Moncef Slaoui, le patron de l’opération Warp Speed aux États-Unis. Un livre haletant, où l’on va de découverte en découverte, en suivant sur plus de trente ans le parcours de scientifiques et d’entrepreneurs : courage et ténacité, inventivité de chercheurs visionnaires et audace des start-up. Après la démonstration des vaccins à ARN, une véritable révolution médicale est en marche, ouvrant des voies thérapeutiques nouvelles pour le cancer et d’autres maladies. Fabrice Delaye est journaliste en Suisse pour Heidi. news. Il suit depuis vingt-cinq ans l’univers des sciences, de la technologie et des start-up. Patrick Aebischer est président émérite de l’École polytechnique fédérale de Lausanne. Médecin et professeur de neurosciences, il est l’auteur de plus de deux cents publications scientifiques et fondateur de nombreuses start-up.

Messenger RNA --- Pharmaceutical technology --- Vaccination --- ARN messagers. --- Vaccins antiviraux. --- Industrie pharmaceutique. --- Pharmacie --- ARN messager --- Vaccins. --- Innovations technologiques. --- usage thérapeutique. --- Viral vaccines --- Pharmaceutical industry --- RNA, Messenger --- Vaccines --- Drug Industry --- therapeutic use --- Innovations pharmaceutiques.