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Le système HLA (human leucocyte antigens), qui signe le complexe majeur d’histocompatibilité humain, occupe une place centrale dans la défense de l’organisme vis-à-vis des agents infectieux, mais aussi dans les phénomènes de rejet de greffes d’organes. Les premières molécules HLA identifiées, les molécules HLA-A, -B et –C (classe I) et les molécules HLA-DR, -DQ, et –DP (classe II), sont des glycoprotéines de surface, capables de fixer et de présenter des peptides antigéniques aux lymphocytes T et d’enclencher des réactions immunitaires. Elles sont très polymorphes et constituent les antigènes majeurs d’histocompatibilité. Depuis quelques années, les techniques sérologiques qui permettent de les caractériser tendent a être remplacées par des techniques de biologie moléculaire, basées sur la PCR (polymerase chain reaction). Celles-ci ont permis, jusqu’à présent, de décupler le nombre d’allèles HLA connus. En fait, chaque spécificité sérologique recouvre plusieurs allèles. La redéfinition du polymorphisme HLA impose donc de réévaluer la notion de compatibilité tissulaire entre donneur et receveur.
Dans la première partie de ce travail, nous avons mis au point et comparé le typage des molécules HLA de classe II par deux techniques de biologie moléculaire. Nous avons montré qu’aucune de ces deux techniques de haute résolution ne permet d’identifier tous les allèles HLA et que toutes deux fournissent un grand pourcentage de typages ambigus. Pour obtenir des résultats non ambigus, l’association des deux techniques s’avère souvent efficace. Grâce à ces techniques combinées, nous avons détecté plusieurs allèles et haplotypes rares et évaluer leur fréquence, l’emploi de techniques de hautes résolution, ainsi que leur mise à jour régulière, s’imposent. Ces résultats illustrent également que le regroupement des allèles en groupes d’allèles de même spécificité sérologique soulève de nombreuses questions quant à la signification physiologique de cette classification.
dans la seconde partie du travail, nous avons étudié l’intérêt des techniques de typage de haute résolution, dans le cadre des greffes de moëlle et de reins. Nous avons typé, de façon prospective, des candidats receveurs de moëlle et leurs donneurs non apparentés et, de façon rétrospective, des receveurs de reins et leurs donneurs cadavres. Nous avons constaté qu’il s’avère virtuellement impossible d’obtenir une compatibilité tissulaire totale entre donneur et receveur, aussi bien pour les greffes de moëlle que pour les greffes de reins. De plus, pour les greffes de reins, les phénotypages ont montré que seuls 8 % des patients présentaient effectivement une identité HLA-DR avec leur donneur, alors que ce taux était évalué à 50% sur base des typages sérologiques.
Les données de la littérature montrent que, dans l’état actuel des connaissances, même de petites variations entre allèles HLA peuvent se révéler importantes. En effet, les expériences in vitro montrent que des molécules HLA codées par des allèles très proches peuvent différer dans leur capacité de fixation et de présentation des peptides. Les données cliniques concernant les greffés médullaires et les greffés rénaux corroborent ces résultats puisqu’elles montrent que des incompatibilités entre les allèles HLA appartenant au même groupe sérologique ou à des groupes différents, peuvent être à l’origine de rejet ou de réaction du greffon contre l’hôte.
Idéalement, donneur et receveur devraient présenter une identité HLA complète. Cependant, le polymorphisme HLA rend cet objectif impossible à atteindre en pratique. De plus, les différentes HLA ne sont pas les seuls facteurs intervenant dans les phénomènes de rejet. Des antigènes mineurs ainsi que des facteurs non spécifiques tels que de cytokines et des molécules d’adhésion y jouent un rôle très important.
Bien que les bénéfices liés à la compatibilité HLA soient limités, le recours aux techniques de biologie moléculaire pour typer tous les antigènes HLA avec un haut degré de précision paraît nécessaire. En effet, plusieurs études tendent à montrer que la compatibilité HLA doit se situer au niveau allélique pour améliorer statistiquement le décours de greffes. De plus, des typages précis permettraient de réaliser des greffes en connaissant la nature exacte des incompatibilités présentes. De tels typages devraient également permettre des études rétrospectives, incluant de grandes séries de greffes. Ces études devraient aboutir à la caractérisation précise des incompatibilités et à l’évaluation de leur impact en transplantation. Ainsi, on pourrait, peut-être, identifier des incompatibilités particulièrement immunogènes et, aussi, mieux comprendre les phénomènes de rejet et de tolérance.

Major Histocompatibility Complex --- Genetic Techniques --- Transplantation --- Graft Rejection

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Le risque de rejet la complication majeure des transplantations de tissus et d’organes. Cette réaction est induite par les lymphocytes T alloréactifs du receveur qui reconnaissent des antigènes d’histocompatibilité différents.
A l’heure actuelle, il n’existe pas de tests permettant d’évaluer de façon certaine les patients susceptibles de faire un rejet. Par ailleurs, l’état de tolérance d’un patient vis-à-vis du greffon qu’il porte est difficilement estimable, étant donné l’administration en continu d’un traitement immunosuppresseur.
Le but de ce mémoire est d’estimer la fréquence serait peut-être en corrélation avec le risque de rejet.
Dans un premier temps, nous avons d’abord effectué la mise au point de la méthode. Pour ce faire, nous avons étudié la sensibilité et la reproductibilité de la technique. Nous avons ensuite établis des valeurs normales grâce à l’estimation des pHTL chez les donneurs sains. Nous avons pu constater que la fréquence est comprises entre 1 / 2.475 et 1/1/6.667 dans la cas de paires « répondantes-stimulantes » ayant des Ag HLA différents, tandis que pour des paires identiques, elle varie de 1/7.123 à 1/333.333. Nous avons également observé que le nombre de pHTL ne variait pas toujours dans le même sens que la MLR.
nous avons ensuite étudié des précurseurs de lymphocytes T auxiliaires au cours du temps ainsi que la culture lymphocytaire mixte chez des patients inclus dans un protocole ayant pour but l’obtention d’une tolérance d’allogreffe rénale par transfusion de sang. Trois groupe de patients furent étudiés : receveurs de transfusions « random » (n=5), des transfusions HLA-DR compatibles (n=4) et de transfusions HLA-DR semi-compatibles (n =4). En ce qui concerne la réponse de la MLR, nous n’avons pas observé de différence entre les 3 groupes puisque les valeurs obtenues diminuaient au décours de la greffe chez l’ensemble des patients. Par contre, pour le suivi de la fréquence des pHTL, nous avons pu constater une différence entre les trois groupes étudiés

T-Lymphocytes --- Major Histocompatibility Complex --- Kidney Transplantation Technology, Medical --- Medical Laboratory Science

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Some T lymphocytes were described as CD8-independent, because they can be activated without the CD8 co-receptor cross-linking with the HLA class I molecules. We isolated CD8-independent CTL clones to study the ability of these CTL to bind a tetramer either at rest or after stimulation. A mutated tetramer carrying two mutations in the 3 domain of the HLA molecules at the contact site with CD8, was used to isolate a CD8-independent anti-MelanA CTL clone. By screening the laboratory's collection of CTL, an anti-MAGE10 clone was also identified as being CD8-independent. At rest, these two clones can bind to both mutated and non-mutated tetramer and the intensity of staining is similar in presence or absence of a blocking anti-CD8 antibody. Previous research in the laboratory indicated that the majority of recently stimulated CD8 T lymphocytes have a reduced capacity to bind to tetramers and to produce cytokines. The suggested explanation is that the TCR and CD8 molecules are not colocalized on the cell surface of these dysfunctional T cells. The CD8-independent CTL clones were used to validate this hypothesis. We studied the staining with a mutated or a non mutated tetramer and tested the production of cytokines from rested or recently stimulated CTL. Staining with the non-mutated tetramer decreased slightly on day 4 compared to day 0 (before stimulation). The production of cytokines remained unchanged. We conclude that the absence of proximity of the TCR and CD8 molecules may be the main explanation for the dysfunction of recently stimulated T cells. The use of FRET (fluorescence resonance energy transfer) technique allows to estimate the proximity between TCR and CD8 molecules and is thus an appropriate technique to identify some anergic T cells in various types of diseases such as cancer or chronic viral diseases. Certains lymphocytes T ont été décrits comme CD8-indépendants parce qu'ils ne nécessitent pas de liaison du co-récepteur CD8 au HLA pour être activés. Nous avons isolé des CTL CD8-indépendants pour étudier leur capacité à se lier à un tétramère, au repos et après stimulation. Un tétramère, doublement muté au site de liaison avec le CD8 dans le domaine 3 du HLA, a été utilisé pour isoler un clone anti-MelanA CD8-indépendant. En criblant la collection de CTL du laboratoire, un clone anti-MAGE10 a aussi été identifié comme étant CD8-indépendant. Au repos, ces deux clones sont marqués par un tétramère non muté et aussi par un tétramère muté. Leur intensité de marquage est similaire en présence ou non d'un anticorps anti-CD8 bloquant. Des travaux au laboratoire ont montré que la plupart des lymphocytes T CD8, dans les jours qui suivent une stimulation, ont une capacité réduite à être marqués par un tétramère et à produire des cytokines. L'explication proposée est que les molécules TCR et CD8 ne sont pas colocalisées à la surface cellulaire de ces lymphocytes T dysfonctionnels. Nos clones CD8-indépendants ont été utilisés pour valider ou infirmer cette hypothèse. Nous avons étudié la capacité de marquage par un tétramère non muté et la production de cytokines des deux clones avant et après stimulation. Comparé à des CTL au repos (jour 0), le marquage par un tétramère non muté ne diminue que faiblement au jour 4 après stimulation et la production de cytokines reste similaire. Nous en concluons que l'absence de proximité des molécules TCR et CD8 serait la cause principale de non fonctionnalité des lymphocytes dans les jours qui suivent une stimulation. L'utilisation du FRET (fluorescence resonance energy transfer) permet d'estimer la proximité entre le TCR et le CD8. Le FRET serait donc une technique adéquate pour identifier des lymphocytes T anergiques dans différents types de maladies telles que cancers ou maladies virales chroniques.

T-Lymphocytes --- CD8-Positive T-Lymphocytes --- Major Histocompatibility Complex --- Genes, MHC Class I --- Genes, MHC Class II