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Theiler’s virus produces, according to the strain, an acute or chronic disease of the central nervous system of the mouse. The neurovirulent strains such as GD7 produce a fatal encephalitis while persistent strains such as DA induce a persistent disease and demyelisation in susceptible mice, despite the immune response. The persistent strain DA unlike the neurovirulent strain GD7 synthesis a protein called 1*. The latter protein increases the infection rate of macrophages by the virus. Macrophages are thought to play an important role in viral persistence and probably in the pathology induced by the virus. Enhancement of macrophage infection by protein 1* was reported to correlate with an antiapoptotic activity of this protein.
Cellular mutants resistant to the GD7 virus have been derived L929 cells in our laboratory. Those mutants have benne classified into 3 groups according to their resistance of susceptibility to different viruses. Some of these cellular mutants (including L929#25 and L929#34) exhibit a particular profile when infected by those viruses. It has turned out that the 1* protein and the replication regions (2A to 3B proteins), beside the viral capsid, influence the infection of these cellular mutants.
We have shown that the presence of the 1* protein and of the 2A-3B region of the DA virus enhance the infection of macrophages. Thos results prompted us to further characterise the L929#25 and L929#34 cellular mutants. We observed that the resistance of those mutants involve a very early stage of the viral cycle (probably just after or the entry of the virus into the cell) and not an increase of their susceptibility to apoptosis as we previously thought. We also constructed and tested new recombinant viruses in attempt to identify the factor of the 2A-3B region that promotes the infection of macrophages and of the cellular mutants. Le virus de Theiler provoque, selon les souches, une maladie aiguë ou chronique du système nerveux central de la souris. Les souches neurovirulentes, comme la souche GD7, provoquent une encéphalite mortelle tandis que les souches persistantes comme la souche DA causent, chez les souris susceptibles, une maladie persistante et démyélinisante en dépit de la réponse immunitaire. LA couche persistante DA exprime, contrairement à la souche neurovirulente GD7, la protéine 1*. Cette dernière facilite l’infection des macrophages, réservoir potentiel du virus lors de la persistance. L’action de cette protéine pourrait s’exercer par un effet antiapoptotique.
Des mutants cellulaires L929 devenus résistants à l’infection par le virus GD7 ont été obtenu dans notre laboratoire. Certains de ces mutants cellulaires (dont les lignées L929#25 et L929#34) présentent un profil d’interaction particulier par les différents virus. Il s’avère que la protéine 1* et la région de réplication (protéines 2A à 3B), outre la capside virale, influencent l’infection de ces mutants.
Nos avons montré que l’infection des macrophages est également facilitée par la présence de la protéine 1* et de la région 2A-3B du virus DA. Cela nous a poussé à caractériser d’avantage les mutants L929#25 et L929#34. Nous avons observé que la résistance de ces mutants intervient dans une étape très précoce du cycle viral (sans doute juste au moment ou après l’entrée du virus dans la cellule) et ne provient pas d’une augmentation de leur sensibilité à l’apoptose comme nous le pensions ? Nous avons construit et testé des virus recombinants pour tenter de mettre en évidence le facteur présent dans cette région 2A-3B qui favorise l’infection des macrophages et des mutants cellulaires.

Theilovirus --- Macrophages --- Infection

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Mycobacterium --- Parasitology --- Macrophages

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MACROPHAGES --- LYMPHATIC SYSTEM --- RETICULOENDOTHELIAL SYSTEM --- MACROPHAGES --- LYMPHATIC SYSTEM --- RETICULOENDOTHELIAL SYSTEM

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Le laboratoire s'intéresse au rôle des lipides bioactifs dans l'inflammation. Dans le cadre de ce mémoire, nous allons particulièrement nous intéresser aux lysophosphatidylinositols (LPI) et à leur récepteur, le récepteur GPR55. En effet, lors d'études préliminaires, le laboratoire a observé une diminution de l'activation des macrophages induite par le lipopolysaccharide (LPS) en présence de LPI. Il nous a donc semblé intéressant de déterminer l'implication du récepteur GPR55 dans l'effet du LPI sur l'activation des macrophages, cellules qui jouent un rôle clé dans les réponses inflammatoires.L'inflammation est un processus biologique ayant pour rôle majeur la défense contre tous types d'agressions. Les monocytes sont parmi les premières cellules du système immunitaire recrutées sur le site de l'agression et vont se différencier en macrophages. Activés, les macrophages vont induire la production de cytokines mais également de médiateurs lipidiques (prostaglandines, leucotriènes,..) synthétisés à partir de l'acide arachidonique. Cet acide gras est libéré sous l'action de la phospholipase A2,entrainant également la libération du LPI. Ce lysophospholipide est l'agoniste endogène principal du GPR55, un récepteur couplé à une protéine G, récemment déorphanisé et considéré pendant un temps comme un récepteur cannabinoide. Par ailleurs, le GPR55 est impliqué dans le développement des tumeurs ainsi que dans la physiologie du système osseux.Pour pouvoir vérifier l'implication du GPR55 dans les effets du LPI, des cellules 1774 (lignée cellulaire de macrophages murins) pour lesquelles le LPI ne diminuait pas l'activation induite par le LPS, ont été transfectées avec un plasmide contenant la séquence codante du GPR55 humain. Après avoir vérifié l'expression du récepteur GPR55 humain dans les cellules transfectées, une sélection clonale a été effectuée.Les effets du LPI ainsi que d'autres ligands du GPR55 ont été testés sur les différents clones obtenus et activés par le LPS. Trois clones ont été sélectionnés pour la suite des études. La présence du récepteur en tant que protéine a été testée par ELISA. Dans les 3 clones, la protéine hGPR55 a pu être observée mais également dans les cellules 1774 sauvages. Le LPI ayant été décrit comme pouvant réguler la prolifération de cellules cancéreuses, nous avons également évalué son effet sur la prolifération cellulaire des cellules transfectées. De manière générale, le LPI induit une diminution de la prolifération cellulaire pour les clones testés. Et finalement, pour déterminer l'activation de la voie de signalisation du GPR55, nous avons vérifié l'activation du second messager ERK.1/2 par western-blet. Une augmentation de l'état phosphorylé est observée dans le clone 12 mais aucune modification en présence du LPI. L'effet du LPI a également été évalué dans des tissus de souris où l'inflammation a été induite par le LPS. Dans le foie, le cervelet et le poumon, le LPI n'induit aucune modification d'expression de cytokines pro-inflammatoires.En conclusion, nous avons mis en évidence une diminution de l'activation des macrophages par le LPI dans certains clones ainsi qu'un effet antiprolifératif du LPI sur ces macrophages. Des études supplémentaires sont requises afin de déterminer l'implication du GPR55 dans les effets du LPI, et le cas échéant déterminer quels récepteurs, si pas le GPR55, sont responsables de ces effets. The laboratory is interested in the raie of bioactive lipids in the inflammation. Inflammation is a biological process essential to hast defense. During inflammation monocytes are among the first cells of the immune system recruited and once in the tissue they differentiate into macrophages. Upon activation macrophages produce, among other mediators, cytokines and lipid mediators (prostaglandins, leukotrienes) derived from arachidonic acid. This fatty acid is released following the action of phospholipase A2, along with lysophosphatidy linositols (LPI). This lysophospholipid is the main endogenous agonist of GPRSS, a recently deorphanized G protein-coupled receptor. To date studies implicated GPRSS in the development of tumors as well as in bone remodeling. Within the framework of this report, we are particularly interested in LPI and the receptor GPRSS in the context of macrophage activation and of inflammation. lndeed, during preliminary studies, the laboratory observed a decrease of the lipopolysaccharide (LPS)-induced activation of a macrophage cell line (J774 cells) in the presence of LPI. Thus, it seemed interesting to determine the implication of GPRSS in the effect of LPI on macrophage activation, as there are key cells in the inflammatory processes. In order to verify the implication of GPRSS in the effects of LPI,J774 cells (a murine macrophage cell line) in which LPI did not decrease LPS-induced activation, were transfected with a plasmid containing the coding sequence of human GPRSS. After confirmat ion of the expression of the human GPRSS receptor in transfected cells, a clonai selection was made. The effects on LPS-induced cell activation of LPI,as well as other ligands of GPRSS, were tested in the various clones obtained. Based on the results, three clones were selected for further investigations. To this end we wanted to detect the protein expression of hGPRSS in these clones, as well as its activation by LPI.Because, LPI was reported to modulate cell proliferation, we also investigated its effects on the proliferation of the clones obtained. Generally, LPI decreased the proliferation of the tested clones.The effect of LPI was also investigated in tissues of mice with LPS-induced inflammation. ln the liver, the cerebellum and the lung, LPI did not affect the LPS-induced expression of pro-inflammatory cytokines.ln conclusion, LPI reduced LPS-induced macrophage activation in some clones and reduced cell proliferation. Further studies are necessary to determine if GPRSS is responsible for the observed effects of LPI,and if not, which receptor(s) are implicated.

GPR55 protein, human --- ‪Lysophosphatidylinositol --- Macrophages

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Obesity belongs to a cluster of metabolic abnormalities (insulin resistance, type 2 diabetes, hypertension, dyslipidemia and hypofibrinolysis) leasing to an increased risk for cardio-vascular disease. There related disorders are components of the Metabolic Syndrome. It has become clear from epidemiological studies that some increase in the adipose tissue mass antedates the development of other disorders.
Adipose tissue (adipose and stromal-vascular fractions) synthesize and release a variety of peptides which may have regulatory properties. I have studied one of these peptides: adiponectin (ApN) is mainly synthesized by mature adipocytes. This hormone has a protective role against atherosclerosis, enhances insulin sensitivity and fatty-acid oxidation. Plasma ApN levels are paradoxically decreased in obese subjects.
To understand this paradoxical decrease, I have studied ApN regulation in visceral fat of lean and obese subjects and examined the contribution of the different adipose tissue fractions to ApN secretion. I have also studied the regulation of ApN gen expression in a non-fat cell, target for the anti-atherogenic effect of ApN , the macrophage.
ApN secretion by visceral adipose explants is decreased in obese subjects. Data from co-cultures (adipocytes / stromal-vascular cells) and adipocyte cultures in conditioned media suggest that stromal-vascular cells may stimulate ApN secretion by adipocyte of lean subjects. However, adipocytes of obese individuals seemed to be resistant to this stimulation. A factor released by stromal-vascular cells could regulate ApN secretion by adipocytes.
We next studied ApN gene regulation in murine macrophages in vivo and in vitro. Intraperitoneal injection of LPS (lipopolyasacharide) to mice reduced plasma ApN levels, but increased ApN mRNA levels in the spleen, a representative organ of mononuclear-macrophage system. In vitro, combination of INF-γ with several cytokines increased ApN Mrna in cultured peritoneal macrophages, while these cytokines exert a well-known inhibitory effect on ApN expression in adipocytes.
In conclusion, a factor released by stromal-vascular cells may regulate ApN secretion in human visceral adipose tissue. Cytokines may induce ApN expression in macrophages, an effect opposite to that observed in adipose tissue L’obésité est un facteur de risqué important, voire crucial dans la pathogénie d’une constellation d’anomalies métaboliques (insulino-résistance, diabète de type 2, hypertension artérielle, dyslipémie et hypofibrinose,…) connu sous le nom de syndrome pluri métabolique. Le tissu adipeux, composé d’une fraction adipocytaire et d’une autre stromale-vasculaire, synthétise et sécrète un grand nombre de facteurs bioactifs, les adipocytokines. Ces dernières on un rôle potentiel dans la pathogénie de ce syndrome. Parmi les adipocytokines, l’adiponectine (ApN) est quasi exclusivement synthétisée par les adipocytes matures. Chez le sujet obèse, les taux circulants d’ApN sont diminués par rapport au sujet mince. Afin de comprendre cette diminution, a priori surprenante, nous avons étudié la régulation de l’ApN dans le tissu adipeux de sujets minces et obèses et examiné la contribution des différentes fractions de ce tissu à la sécrétion d’ApN. Nous avons élargi cette étude à la régulation de l’expression du gène ApN dans une cellule non-adipeuse, me macrophage.
Nous avons d’abord confirmé l’existence dans le plasma du monomère d’ApN 530 kDA) dans des conditions réductrices, ainsi que celle de complexes de plus haut poids moléculaire dans les conditions natives. In vitro, la sécrétion d’ApN par les explants de tissu adipeux viscéral est diminuée chez les sujets obèses. Nous avons mené des expériences de co-culture (adipocytes/ cellules stromales-vesculaires) ainsi que des cultures d’adipocytes en milieu conditionné par des cellules stromales-vasculaires. Les cellules stromales-vasculaires stimulerait la sécrétion d’ApN par les adypocytes de sujets minces. Par contre, les adipocytes de sujets obèses semblent résistants à cette stimulation. Il existerait donc un facteur libéré par la fraction stromale-vasculaire contrôlant la production d’ApN par les adipocytes.
Nous avons ensuite étudié la régulation de l’ApN dans les macrophages murins in vivo et in vitro. Chez la souris, le traitement au LPS (lipopolysaccharide) diminue les taux plasmatiques d’ApN lais par contre, augmente les taux d’ARNm ApN dans la rate, organe représentatif du système mononucléaire-macrophage. In vitro, l’association de plusieurs cytokines augmente les taux d’ArNm ApN dans des macrophages péritonéaux en culture, alors qu’elle exerce un effet inhibiteur bien connu sur l’expression de ce gène dans le tissu adipeux

Adipose Tissue --- Macrophages --- Blotting, Northern --- Blotting, Western