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The tetramer technology is widely used to detect in the blood cytolytic lymphocyte T (CTL) directed against a particular peptide. Using tetramers, we have tried to isolate in the blood of a non-cancerous individual a CTL specific for a MAGE-1-peptide presented by HLA-A2 molecules. Experiments performed recently in the group of H.G. Ramenssee have demonstrated that this peptide is presented at the surface of HLA-A2 tumor cells expressing MAGE-1. We have followed two different protocols. Firstly, CD8+ T lymphocytes were sorted from a population of T lymphocytes and, then, cells bonding to an A2.MAGE-1 tetramer were isolated by flow cytometry and expanded in clonal conditions. We have obtained some CTL clones that were weakly labelled by the tetramer but unable to lyse HLA-A2 cells loaded with the peptide. Secondly, we have labeled T lymphocytes from another donor both with the A2.MAGE-1 tetramer and a second antibody coupled to magnetic beads.The positive population, which was obtained after a passage through a column surrounded by a magnetic field, was analyzed by flow cytometry. CD8+ tetramer+ cells were sorted but did not proliferate. Further experiments will be performed in the laboratory.
Surprisingly, tetramers can also be used to analyze the functions of CTL. Nathalie Demotte showed in the laboratory that a CTL clone lost its specific lytic activity when it was stimulated with B lymphocytes resenting the antigen. The phenomenon was also observed when the clone was stimulated with phytohemaglutinine. On the contrary, this clone kept its lytic ability when it was stimulated with tumor cells. The loss of lytic activity correlates with a loss of staining by a relevant tetramer. The functional defect was not due to a decreased surface expression of TCRαβ molecules, but the TCR-CD3 complexes are clustered I, patches on all the active CTL whereas their distribution is much more uniform on the inactive CTL. This suggests that TCD preaggregation is necessary for CTL functioning and tetramer staining. The functional defect is reversible when cells were cultivated with a supernatant of activated lymphocytes. We have repeated observations with other CTL clones these and have shown that the functional defect is not limited to one particular clone. It is clear that, both in mice and humans, tetramers stain T cells that do not exert cytotoxicity or cytokine secretion. On the basis of these results, it could have been thought that tetramer analysis reveals all the T cells directed against a particular epitope, regardless of their functionality. Our results demonstrate the existence of functionally arrested T cells, which escape detection by tetramer La technique de tétramère HLA-peptide a été largement utilisée pour détecter la présence de lymphocytes T cytolytiques (CTL) dans le sang. Nous avons tenté d’isoler, à partir du sang d’un individu non cancéreux, des CTL reconnaissant spécifiquement un peptide de MAGE-1 présenté par des molécules HLA-A2 en utilisant un tétramère HLA-peptide. Nous savions, par les travaux réalisés au laboratoir de H.G. Rammensee, que ce peptide était présenté par des cellules tumorales HLA-A2 exprimant MAGE-1. Deux protocoles ont été envisagés. Le premier consistait à trier les lymphocytes T CD8+ à partir d’une population de lymphocytes T et à isoler les cellules se liant à un tétramère A2.MAGE-1 par cytométrie de flux. Nous avons obtenu des CTL faiblement marqués par le tétramère. Cependant, ces CTL étaient incapables de reconnaître des cellules présentant le peptide. Dans le second protocole, les lymphocytes T ont été marqués avec le tétramère et avec un deuxième anticorps couplé à des billes magnétiques. Après passage sur une colonne entourée d’un champ magnétique, la population positive a été analysée par cytométrie de flux. Les cellules CD8+ tétramère+ ont été isolées mais n’ont pas proliféré. D’autres expériences de ce type seront réalisées ultérieurement au laboratoire.
D’une manière plus surprenante, le tétramère HLA-peptide peut également être utilisé comme outil pour analyser les fonctions d’un CTL. Les travaux effectués au laboratoire par Nathalie Demotte ont montré qu’un clone de CTL perdait son activité lytique lorsqu’il était stimulé avec des lymphocytes B présentant l’antigène. Le phénomène a également été observé lorsque les CTL ont été stimulé avec de la phytohémaglutinine. Par contre, ce clone était capable de lyser des cibles spécifiques lors de stimulations avec des cellules tumorales. Des expériences ultérieures ont montré que la perte d’activité lytique est corrélée à une perte de marquage tétramère HLA-peptide. Le défaut fonctionnel n’est pas dû à une diminution de l’expression des TCR à la surface. Les complexes TCR-CD3 sont rassemblés par petits groupes préagrégés à la surface des cellules actives, par contre, la distribution de ces complexes est plus uniforme à la surface des cellules inactives. Ceci suggère qu’on préagrégation des TCR est indispensable pour l’activation d’un lymphocyte T et pour le marquage par un tétramère relevant. Le défaut fonctionnel est réversible lors de l’addition d’un surnageant de lymphocytes activés à la culture cellulaire. Nous avons reproduit ces résultats sur d’autres clones afin de montrer que le défaut fonctionnel n’est pas limité à un seul clone.
Plusieurs études ont montré, aussi bien chez la souris que chez l’homme, que les tétramères détectent également les CTL non cytolytiques ou non sécréteurs de cytokines. Ces résultats suggéraient qu’une analyse tétramère révèle tous les CTL spécifiques d’un peptide, indépendamment de leur état fonctionnel. Nos résultats démontrent l’existence de CTL inactifs échappant à la détection par le tétramère

Epitopes, T-Lymphocyte

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In mice chronically infected with a virus, T lymphocytes undergo persistent activation and stimulation which results in a dysfunctional state known as "T cell exhaustion". In this state, T cells lack effector functions and are unable to proliferate. This loss of function has been attributed to the presence of inhibitory receptors. In several pathologies like chronic viral infection, graft or cancer, human T cells are also continuously exposed to their specific antigen. By analogy with the murine T cells observed in chronically infected mice, human T cells have also been described as exhausted. However the role of inhibitory receptors has not been proven in human T lymphocytes. We have proposed to reconsider this issue with in vitro expanded human T cells. To mimic antigen persistence, a protocol of repeated stimulations of human T cells has been developed. The T cells obtained with this protocol become dysfunctional, but the implication of inhibitory receptors has been ruled out. The dysfunctional T cells have been compared to their functional counterparts by transcriptome analysis. Several genes that were differentially expressed were identified. We decided to focus on 3 main candidates: TIMP3 and SPARC which are upregulated in dysfunctional T cells and ITK which is down regulated. I obtained dysfunctional T cells using the repeated stimulations protocol, either using stimulating T2 cells or stimulating dendritic cells, each of them loaded with a relevant antigenic peptide. I confirmed the upregulation of TIMP3 and SPARC genes in dysfunctional T cells and confirmed this increase at the protein level. This upregulation is particularly significant, as these candidate genes are not expressed in functional T cells. I also analyzed their expression in T cells extracted from several human pathologies samples and interestingly, I was able to demonstrate their expression in this context. I forced the expression of either TIMP3 or SPARC by lentiviral infection of functional T cells. On the other hand, I used polyclonal antibodies directed against TIMP3 and SPARC proteins, and evaluated the impact on T cell functions. This treatment allowed a slight increase in T cell functions in a single experiment. In order to identify the action mechanism of TIMP3 in T cell, I used chemical inhibitor to mimic its action by inhibiting its targets in functional T cells. I evaluated their functions, but no impact was noted. Regarding ITK, I forced its expression in functional T cells, which will undergo the repeated stimulation protocol. This will allow evaluating whether its expression is sufficient to maintain T cell functions. I also used chemical inhibitors to reproduce the loss of its expression; it induced a negative impact on T cells functions.In the future, if the implication of the candidate genes is confirmed, it will be possible to consider broader perspectives. For example, the transfer of T cells which would be genetically modified either to suppress or sustain the expression of the candidate genes could be considered. Lors d'infections murines chroniques, les lymphocytes T sont soumis à des stimulations permanentes qui entrainent l'apparition d'un état « épuisé ». Ce dysfonctionnement est dû à l'expression majorée de récepteurs inhibiteurs. Dans diverses pathologies comme les infections virales chroniques, le cancer ou les greffes, les lymphocytes T humains subissent ce même type d'exposition continue à leur antigène. Par analogie avec les pathologies murines, les lymphocytes T humains ont également été qualifiés d' « épuisés ». Chez l'homme, toutefois, l'implication des récepteurs inhibiteurs n'a pas été démontrée. Afin d'imiter la persistance de l'antigène, un protocole de stimulations répétées des lymphocytes T a été mis en place. Les lymphocytes T obtenus sont dysfonctionnels, mais l'implication des récepteurs inhibiteurs a été exclue. Une analyse de transcriptome a été réalisée pour comparer ces lymphocytes T dysfonctionnels aux lymphocytes T fonctionnels. Plusieurs gènes différentiellement exprimés ont été identifiés. Nous nous sommes focalisés sur 3 candidats : TIMP3 et SPARC qui sont surexprimés dans les lymphocytes T dysfonctionnels, et ITK qui voit au contraire son expression diminuer. J'ai obtenu des lymphocytes T dysfonctionnels par ce protocole, en employant d'autres types de cellules stimulantes : des cellules T2 ou des cellules dendritiques en tant que cellules stimulantes. J'ai confirmé la surexpression des gènes TIMP3 et SPARC dans les lymphocytes T dysfonctionnels, et mis en évidence leur expression protéique. J'ai également détecté leur expression dans des lymphocytes T extraits de diverses pathologies humaines. Concernant les gènes candidats, j'ai agi sur leur expression génique d'une part et sur leurs fonctions protéiques d'autre part. Concernant TIMP3 et SPARC, j'ai induit leur expression dans des lymphocytes fonctionnels par infection lentivirale. Dans le cas d'ITK, j'ai induit son expression dans des lymphocytes T fonctionnels qui seront soumis au protocole de stimulation chronique. Cela permettra d'évaluer si le maintien de son expression est suffisant pour protéger les lymphocytes T de l'état dysfonctionnel. J'ai employé des anticorps polyclonaux dirigés contre les protéines TIMP3 et SPARC. Ils ont permis une légère augmentation des fonctions lymphocytaires dans une expérience unique. Par ailleurs, afin d'identifier le mécanisme d'action de TIMP3 dans les lymphocytes T, j'ai mimé son action par l'inhibition de ses cibles dans des lymphocytes T fonctionnels. Cela n'a eu aucun impact sur les fonctions lymphocytaires. Concernant ITK, j'ai employé un inhibiteur chimique qui a exercé un impact négatif sur les fonctions lymphocytaires. A l'avenir, si l'implication des protéines candidates TIMP3 et SPARC se confirme, des perspectives plus larges seront envisageables. Au vu de leur action inhibitrice sur le système immunitaire, il serait intéressant d'inhiber leur action dans le cas d'infections virales chroniques ou de cancer. Au contraire, leur présence constituerait un atout dans le cas de pathologies auto-immunes ou de greffes. Si leur implication est infirmée, il serait intéressant de considérer les autres gènes candidats identifiés par l'analyse de transcriptome. L'intervention d'autres mécanismes également, épigénétiques par exemple, ne doit pas être négligée.

T-Lymphocytes --- Lymphocyte Function-Associated Antigen-1

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nf-kappa b --- proto-oncogene proteins --- lymphocyte transformation --- t-lymphocytes --- neoplasms --- nf-kappa b --- proto-oncogene proteins --- lymphocyte transformation --- t-lymphocytes --- neoplasms

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Immune response --- peptides --- lipoproteins --- Peptide de synthese --- Lymphocyte t cytotoxique --- Stimulation in vivo --- Protocole boc-tfa --- Protocole fmoc-piperidine --- Peptide de synthese --- Lymphocyte t cytotoxique --- Stimulation in vivo --- Protocole boc-tfa --- Protocole fmoc-piperidine

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Biologie --- Immunologie --- Immunity --- Immunité --- Allergy and Immunology --- immunity --- Antigène --- Antigens --- Lymphocyte --- lymphocytes --- Réponse immunitaire --- Immune response --- Pouvoir pathogène --- Pathogenicity --- Néoplasme --- Neoplasms --- Anticorps monoclonal --- monoclonal antibodies --- Génie génétique --- genetic engineering --- Immunité --- Immunity. --- Immune systems